表观遗传在牙发生和牙再生中的作用及意义

周晨凌均棨.中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院正畸科 广东省口腔医学重点实验室 广州 50055；.中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院牙体牙髓病科 广东省口腔医学重点实验室 广州 50055



表观遗传在牙发生和牙再生中的作用及意义

周晨1凌均棨2
1.中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院正畸科 广东省口腔医学重点实验室 广州 510055；
2.中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院牙体牙髓病科 广东省口腔医学重点实验室 广州 510055

［摘要］表观遗传是指DNA序列不发生变化，基因表达却发生了可遗传改变的一种遗传方式，主要涉及DNA甲基化和组蛋白的不同翻译后修饰，决定了特定的基因表达形式。DNA甲基化常引起基因表达抑制，而脱甲基化则引起基因表达开放。组蛋白有众多的共价修饰形式，根据修饰的种类、位点及个数的不同，引起基因沉默或激活。表观遗传修饰是细胞定向分化和重编程中基因特异性表达的重要调控方式，在机体发生中扮演着重要的角色。在牙发生过程中，表观遗传与传统的基因表达调控协同，调节细胞增殖、分化和迁移相关基因的时空表达，最后导致牙的形成。诠释牙发生过程中的表观遗传调控机制，无疑可为牙再生提供关键的线索和思路。

［关键词］牙发育；基因表达调控；表观遗传；牙再生

牙发育主要分为牙板形成、蕾状期、帽状期和钟状期等过程［1］。其细胞学基础是牙源性上皮组织与外胚间质组织序贯性的相互作用诱发细胞增殖、迁移及定向分化，激发相关的发生生物学过程并导致牙的形成；其分子基础是上皮与外胚间质组织通过细胞—细胞间相互作用、细胞—细胞外基质相互作用以及分泌的生长因子，相互之间进行信号转导，引起牙发生相关基因的时空精确表达［2-3］。研究［4-5］显示，有成百上千种基因在牙发生的各个时期特异性表达，探讨牙相关基因的这种时空表达规律及其调控因素，对研究牙发生的基础理论和探讨牙再生具有重要的理论意义和临床价值。

与其他器官的发生过程类似，牙发生过程中基因时空特异性表达同样受到精确的调控，具体涵盖从DNA转录起始到蛋白质降解的各个环节，包括DNA甲基化和组蛋白修饰水平的表观调控，转录因子介导的转录调控，牙发生在RNA水平的转录后调节，翻译后修饰及蛋白质降解［6-7］。表观遗传系指在DNA序列不发生改变的情况下，生物的表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化。即指亲代细胞在有丝分裂时，有能力把自己的一整套基因信息传递给子代细胞，主要包括DNA甲基化和组蛋白共价修饰［8-9］。这种DNA的甲基化修饰和组蛋白的共价修饰决定了特定的基因表达形式。其中，DNA甲基化常引起基因表达抑制，而脱甲基化则引起基因表达开放。与DNA甲基化修饰不同，组蛋白有着众多的共价修饰形式，包括甲基化、乙酰化、泛素化和磷酸化等。根据修饰的种类和位点以及修饰的个数不同，这些修饰或者引起基因沉默，或者引起基因激活［10］。表观遗传修饰是细胞定向分化和重编程中基因特异性表达的重要调控方式，在机体发生中扮演着重要的角色。在牙发生过程中，表观遗传修饰同样是牙不同细胞定向分化的分子基础。目前，表观遗传相关基因在牙发生中的时空表达和功能研究仍处于起步阶段。

1　DNA甲基化和脱甲基化及羟甲基化与基因表达调控

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，是以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，由DNA甲基转移酶（DNA methyl transferase，DNMT）催化的反应。DNA甲基化修饰包括将腺嘌呤转变为N-甲基腺嘌呤，将胞嘧啶转变为N-甲基胞嘧啶，将胞嘧啶转变为C-甲基胞嘧啶。原核生物中这3种类型均存在，但在高等真核生物中只存在第3种类型，即5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）［11-12］。CpG二核苷酸是真核细胞基因组DNA最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布。在某些区域中，CpG的出现率持平或高于正常，这些区域被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子，在基因组中约有60%以上基因的启动子区含有CpG岛［13］，其甲基化修饰是该基因表达最重要的调控方式之一。

甲基化通常旨在抑制目的基因表达，然而脱甲基化则是基因表达的前提。DNA甲基化所致相关基因沉默的机制之一是甲基化胞嘧啶结合蛋白（methylcytosine binding protein，MeCP）与甲基化DNA结合并形成复合物，该复合物诱导染色质组蛋白脱乙酰酶，进而导致染色质构象改变，阻碍转录因子与DNA结合，最终抑制基因转录。DNA的甲基化状态同时对染色体的结构维持、X染色体失活、基因印记至关重要，在胚胎发生、健康细胞功能维持中发挥着重要的作用，其异常则会导致疾病的发生［14］。

甲基化模式有两种：一是维持性甲基化，指在细胞分裂过程中，根据亲本链上特异的甲基化位点在新生链相应位置上进行甲基化修饰（维持性甲基化由DNMT1和DNMT2完成）；二是从头甲基化（de novo methylation），即催化未甲基化的CpG位点甲基化，主要由甲基化转移酶DNMT3A 和DNMT3B催化完成［15］。

DNA的脱甲基化状态始终处于动态调控中，但是在过去相当长的一段时间内，未能发现催化DNA脱甲基化的酶，人们一直认为，脱甲基化只能通过阻止新生DNA链发生DNA甲基化而达到被动的脱甲基化。研究［16-17］显示，生长扑捉和DNA损伤诱导蛋白质（growth arrest and DNA damage inducible protein，GADD）45A可通过DNA损伤修复的机制来去除5-mC的甲基化，从而拉开DNA主动脱甲基化的序幕；然而该现象也颇受质疑，Jin等［18］认为，GADD45A可能不参与DNA的脱甲基化。近年来，染色体10易位到11蛋白（ten-eleven translocation，TET）1的发现将脱甲基化研究推向新的热点。TET1可羟基化5-mC，而羟甲基化可能在DNA脱甲基化过程中扮演重要的角色。在Dnmt1或Np95/Uhrf1基因敲除小鼠的胚胎干细胞（embryonic stem，ES）中，5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）质量明显少于野生型小鼠ES细胞，而在Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b三种基因同时敲除的小鼠ES细胞中，5-hmC几乎全部消失，即5-hmC来源于之前存在的5-mC［19-23］。过表达TET1则可将某些5-mC转化为5-hmC或普通的胞嘧啶；脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽1可增强该脱甲基化过程［24］。除TET1外，TET2和TET3皆具有相似的功能（表1）。

表1　DNA甲基化/羟甲基化修饰相关的酶及识别DNA甲基化的转录调控相关基因Tab1　DNA methylation/hydroxymethylation related enzymes and transcriptional regulating genes that recognize methylated DNA

2　组蛋白修饰与基因表达

核小体是染色质的基本组成单位，每个核小体由146 bp的DNA围绕组蛋白八聚体形成。组蛋白八聚体由各两个分子的H2A、H2B、H3和H4四种组蛋白构成。组蛋白与细胞内遗传物质DNA密切结合，控制染色质的结构，进而影响基因的表达。组蛋白翻译后修饰所引起的染色质结构重塑在真核生物基因表达调控中发挥着重要的作用，是表观遗传的另一重要方式［25］。

组蛋白存在多种共价修饰，例如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等，其中乙酰化研究得最早也是基因转录调控最重要的机制之一［26］。组蛋白乙酰化状态主要由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）催化完成［27］。HAT通过催化组蛋白N端赖氨酸残基乙酰化，疏水的乙酰基使组蛋白-DNA之间的静电吸引降低且空间位阻增大，相互作用减弱，进一步导致染色质结构松散，进而使DNA容易与转录因子结合，有利于基因转录；反之，HDAC是乙酰化的组蛋白脱乙酰酶，促使带正电的组蛋白与带负电的DNA紧密结合，染色质呈致密结构，抑制转录因子的结合，导致基因转录阻遏。

组蛋白甲基化和脱甲基化是组蛋白修饰的另一种重要形式，在基因表达调控中同样扮演着重要的角色［28］。组蛋白甲基化主要是指赖氨酸（K）残基和精氨酸残基的甲基化，该修饰在异染色质的形成、X染色体的失活和转录调控等许多生物学过程中都发挥了重要的作用，是细胞增殖、分化与器官发生重要的调控环节，其异常会导致异常或肿瘤等疾病。组蛋白赖氨酸的甲基化是迄今为止研究得最为充分也是最复杂的甲基化修饰，主要包括组蛋白H3的K4、K9、K27、K36和K79和组蛋白H4的K20的甲基化。组蛋白的甲基化都是由组蛋白甲基转移酶完成的。截至目前，数十种组蛋白甲基转移酶相继得以发现。SUV39蛋白是最早被发现的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，可直接作用于组蛋白H3的第9位赖氨酸，使之甲基化［29］。SUV39蛋白上高度保守的SET结构域为其催化结构域，该结构域得名于参与果蝇表型遗传的3个基因Su（var）3～9、Ez（Enhanccr zcstc）和Trithorax。除了蛋白H3K79甲基转移酶端粒沉默扰乱子（dis-ruptor of telomeric silencing，DOT）1外，其他组蛋白赖氨酸甲基化酶都含有SET结构域，不同组蛋白甲基转移酶可以特异性地修饰组蛋白的不同位点（表2）；而不同的组蛋白修饰对基因的表达调控也不一。组蛋白H3K9的甲基化与基因的失活正相关，而H3K27的甲基化也与许多基因沉默正相关，H4K20甲基化同样是转录抑制的表观遗传标志；相反，H3K4的甲基化则和基因转录激活密切相关［30-31］。

除了赖氨酸甲基化外，组蛋白的精氨酸也会发生甲基化，这种甲基化主要由蛋白精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）催化完成［32］。根据蛋白质结构序列特征，在人体内已经鉴别出11种PRMT，除PRMT2、10 和11之外，其他PRMT都具有催化精氨酸甲基化的能力，而PRMT1、4、5、6、7和9还具有特异的组蛋白精氨酸甲基转移酶活性。其中，PRMT1和4催化的甲基化多引起基因转录激活，而PRMT5和6诱导的组蛋白甲基化修饰则引起基因转录的抑制（表2）。此外，PRMT7和9的功能有待进一步的研究。

除甲基化和乙酰化外，组蛋白还受到磷酸化和遍在蛋白化（旧称泛素化）修饰；其在基因表达调控和表观遗传中作用的研究不及甲基化和乙酰化充分。综上可见，表观遗传学，尤其是对DNA甲基化修饰、组蛋白乙酰化和甲基化的深入阐释，有助于更好地理解基因表达调控、细胞增殖分化的机制。

3　牙发生过程中表观遗传的相关研究

牙发生依赖于牙上皮和外胚间质之间精确和复杂的相互作用，该过程涉及细胞增殖、分化和迁移等环节，是研究器官发生的常用模型和切入点。传统的分子生物学和发生生物学侧重于研究上皮—间质细胞间信号的转导、靶细胞转录因子的活化及其对终末分化基因的表达调控。近年来，随着表观遗传基础研究的发展，牙发生过程中表观遗传的相关机制备受关注。早在20世纪90年代就有研究［33-35］显示，部分同卵双生的双胞胎牙表型（缺失、锥形和过小的侧切牙）差异明显。由于同卵双生的双胞胎含有相同的基因组，因此，该现象提示牙的发生受到了经典遗传以外的因素影响。换言之，在牙发生过程中，营养等微环境可能通过表观遗传等机制调节牙的发生。

早期牙发生的关键事件为上皮细胞和间质细胞定向分化为成釉细胞和成牙本质细胞，无论是上皮细胞还是间质细胞，其分化都存在大量的表观遗传改变［36-37］。

成釉蛋白（ameloblastin，AMEL）是牙发生过程中最为重要的细胞外基质之一，编码AMEL的基因位于X染色体的AMELX Xq22和Y染色体的AMELY Yp11两个位置。来源于AMELY的转录本只占整个转录本的10%，表明这2个等位基因编码AMEL的效率并非相同，而DNA甲基化是AMEL的重要调控方式。截至目前，DNA甲基化与釉质发生的关系仍不清楚，尤其是在釉质发生障碍中的作用还不清楚。探讨调控AMEL的DNA甲基化机制、AMEL启动子的甲基化程度、在牙发生过程中的动态变化，是研究DNA甲基化在牙发生中的功能的突破口。另一方面，Kamiunten等［38］在系统研究H3K9的甲基转移酶在牙发生过程中的表达变化时发现，G9a、Glp、Prdm2和Suv39h1四个甲基转移酶在牙胚中高表达，在胚胎期16.5或17.5时，表达达到峰值。他们认为组蛋白甲基化转移酶，特别是上述4种在牙发生中细胞定向分化等过程中可能发挥了重要的作用。

体外研究显示，组蛋白脱甲基化酶［lysine（K）-specitic demethylase，KDM］6B（又称为JMJD3）高度表达于牙源性间质细胞，假如通过RNA干扰其表达，可以降低细胞的骨向和牙向分化，假如补充KDM6B则能恢复其牙向分化能力。其机制是KDM6B可增加骨形态发生蛋白2启动子区的H3K27的脱甲基化，促进其基因表达，而骨形态发生蛋白2是牙间质细胞分化最为重要的信号分子之一［39-40］。与此相似，干涉人牙乳头干细胞可以增强Sox2和关键蛋白基因启动子区的H3K4甲基化，促进其表达，进而增加其细胞成脂和成软骨分化［41］，即KDM2A可能在牙发生的细胞定向分化过程中扮演重要角色。进一步探讨KDM2A在牙发生过程中的表达变化及其敲除对牙发生整体的影响，将为了解该基因的功能以及更好地理解牙发生的机制提供关键信息。Du等［42］在研究中发现，组蛋白脱甲基化酶KDM2A可以通过促进上皮调节蛋白（epiregulin，EREG）基因启动子区组蛋白的K4/36甲基化抑制基因的表达，抑制间质干细胞的成骨和成牙分化。

牙发生过程中除了涉及组蛋白和DNA甲基化动态调控外，组蛋白乙酰化修饰改变同样参与其中。过表达乙酰转移酶P300的牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）在分化培养条件下，牙本质细胞相关基因牙本质基质蛋白-1、牙本质涎磷蛋白、牙本质涎蛋白、牙本质涎蛋白和骨钙蛋白等明显增加［43］；反之，组蛋白脱乙酰酶酶抑制剂曲古柳菌素明显增加DPSC的增殖和成牙本质向分化，即组蛋白乙酰化修饰可能是牙本质发生的重要机制［44］。

目前表观遗传在牙发生和牙再生中的研究还位于起步阶段，现有的发现也只是表观遗传在牙发生生物学的一小部分，前面所涉及的众多表观遗传修饰的酶和相关调控分子在牙发生中的表达和功能尚处于空白。进一步探讨其他在牙发生中表观遗传修饰酶，它们自身如何变化、如何靶向调控牙发生相关基因的时空表达等，对深入认识牙发生的机制具有重要意义。目前，大多数的研究还只是集中在牙源性干细胞的细胞学研究，进一步利用转基因和基因敲除动物模型探讨牙发生过程中表观遗传机制是迫切和必要的。

4　小结

牙胚重组研究［45-47］显示，胚胎10.5～12.5 d的牙胚上皮或14.5 d的牙胚间质具有诱导牙再生的能力，即将ES或者诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）定向分化为胚胎10.5～12.5 d的牙源性上皮细胞或14.5 d的牙源性间质细胞有望实现牙再生。由此可见，成功诱导细胞定向分化为目的细胞成为牙再生的关键［48］。事实上，无论是诱导成纤维细胞为iPSC还是iPSC定向分化为成熟的体细胞，都涉及表观遗传的改变［49］；相反，如果不能清除必要的表观遗传标志物，则会引起细胞分化潜能障碍［50-51］。另一方面，调控表观遗传则能增加成体细胞变为iPSC的效率或者干细胞定向分化为靶细胞的效率［52-53］。诠释成釉细胞和成牙本质细胞定向分化过程中重要的表观遗传标志物的改变及其调控机制，将会为定向诱导获得胚胎10.5～12.5 d的牙源性上皮细胞或14.5 d的牙源性牙间质细胞提供重要线索和思路，从而为牙再生提供种子细胞，最终促进牙再生的实现。

综上可见，表观遗传是牙发生过程中重要的分子事件。牙发生过程中表观遗传与传统的基因表达调控协同，调节细胞增殖、分化和迁移相关基因的时空表达，最后导致牙的形成。诠释牙发生过程中的表观遗传调控机制，无疑将会为牙再生提供关键的线索和思路。

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（本文采编王晴）

Epigenetics in tooth development and its implication in tooth regeneration

Zhou Chen1，Ling Junqi2.（1.Dept.of Orthodontics，Guanghua School of Stomatology，Hospital of Stomatology，Sun Yat-sen University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology，Guangzhou 510055，China；2.Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics，Guanghua School of Stomatology，Hospital of Stomatology，Sun Yat-sen University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology，Guangzhou 510055，China）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（81170932） and Special Talents Fund in Guangdong Province（52000-3210002）.

［Abstract］Epigenetics，mainly including DNA methylation and histone post-translational modification，is the heritable changes that are not caused by changes in the DNA sequence；this change also alters how genes are expressed.DNA methylation typically causes gene transcriptional silencing，whereas demethylation leads to transcription activation.A large number of covalent modifications on histone，such as different types，residues，and amount，will affect the inhibition or activation of gene expression.Epigenetic modifications play pivotal roles in organogenesis by controlling gene expression during cell fate determination and reprogramming.In the process of tooth development，complex orchestration between genetic and epigenetic programs regulates the spatiotemporal expression of cell proliferation-，differentiation-，and migration-related genes，and finally tooth formation.Exploring the molecular biology of epigenetic，together with the epigenetic findings in tooth development，is not only fundamental but also inspiring for tooth regeneration.

［Key words］tooth development；gene expression and regulation；epigenetics；tooth regeneration

［收稿日期］2015-06-30；［修回日期］2016-02-23

［基金项目］国家自然科学基金（81170932）；广东省领军人才专项经费（52000-3210002）

［作者简介］周晨，博士，Email：zhouchen@mail2.sysu.edu.cn

［通信作者］凌均棨，教授，博士，Email：lingjq@mail.sysu.edu.cn

［中图分类号］Q 786

［文献标志码］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.015