牙龈卟啉单胞菌及其牙龈蛋白酶K对青少年牙龈健康的影响

韩志强柏扬肖水清孙菲何萍.济南市口腔医院 济南 5000；.济南市第一人民医院口腔科 济南 50000；.滨州医学院口腔医学院正畸教研室 滨州 5660



牙龈卟啉单胞菌及其牙龈蛋白酶K对青少年牙龈健康的影响

韩志强1柏扬2肖水清1孙菲3何萍1
1.济南市口腔医院 济南 250001；2.济南市第一人民医院口腔科 济南 250000；3.滨州医学院口腔医学院正畸教研室 滨州 256603

［摘要］目的分析牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）及牙龈蛋白酶K（Kgp）对青少年牙龈健康的影响。方法收集12～17岁青少年牙龈正常组（50例）、牙龈炎症指数Ⅰ级组（25例）和牙龈炎症指数Ⅱ级组（32例）的3组龈沟液标本，应用16S rDNA PCR技术检测各样本中的P.gingivalis及Kgp。3组P.gingivalis和Kgp阳性检出率的比较采用χ2检验；P.gingivalis和Kgp的相对含量与牙龈炎症指数之间的关系采用Spearman相关分析。结果P.gingivalis在牙龈炎症指数Ⅰ级组的检出率大于牙龈正常组，牙龈炎症指数Ⅱ级组的检出率大于牙龈炎症指数Ⅰ级组和牙龈正常组，牙龈炎症指数Ⅰ级组、Ⅱ级组与牙龈正常组间有明显差异（P＜0.01），牙龈炎症指数Ⅰ级组与Ⅱ级组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。Kgp在牙龈炎症指数Ⅰ级组的检出率大于牙龈正常组，牙龈炎症指数Ⅱ级组的检出率大于牙龈炎症指数Ⅰ级组和牙龈正常组，牙龈炎症指数Ⅰ级组与牙龈正常组间差异具有统计学意义（P＜0.05），牙龈炎症指数Ⅱ级组与牙龈正常组间有明显差异（P＜0.01）。P.gingivalis和Kgp的检出率随着牙龈炎症指数的增加而升高。结论P.gingivalis和Kgp与青少年牙龈健康密切相关。

［关键词］青少年；牙龈卟啉单胞菌；牙龈蛋白酶K；牙龈炎

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）被认为是慢性牙周炎最主要的致病菌，可产生多种毒力因子，其中牙龈素是牙龈卟啉单胞菌表面的一组蛋白酶，依据作用底物不同，可划分为赖氨酸特异性牙龈蛋白酶（gingipain K，Kgp）和精氨酸特异性牙龈蛋白酶；其中，Kgp是最有潜能的纤维蛋白降解酶，在P.gingivalis致病性中起着重要作用［1］。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术具有高敏感性和特异性，被广泛应用于病原微生物的检测。本研究采用16S rDNA PCR技术直接检测青少年龈沟液的P.gingivalis，并对其相关毒力因子Kgp进行检测，结合牙龈炎症指数进行分析研究，以探讨青少年龈沟液中P.gingivalis阳性个体中Kgp对牙龈健康的影响。

1　材料和方法

1.1主要试剂、仪器和实验菌株

2×EasyTaq PCR SuperMix PCR试剂盒、细菌基因组提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；引物（上海博尚生物技术有限公司合成）；梯度PCR仪（T-Gradient Thermoblock Biometra）、水平电泳槽、PAC-300型电泳仪制胶器和Gel-Doc2000凝胶成像和分析系统（Bio-Rad科技有限公司，美国）；P.gingivalis W83菌株（首都医科大学医学研究中心）、P.gingivalis ATCC33277菌株、伴放线菌嗜血菌ATCC29522 菌株、具核梭杆菌ATCC25586菌株（口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学）。

1.2研究对象

从济南市口腔医院正畸科、口腔内科随机选择年龄在12～17岁之间的青少年作为研究对象。其中牙龈正常组50例（男15例、女35例），牙龈炎症指数Ⅰ级组25例（男11例、女14例），牙龈炎症指数Ⅱ级组32例（男15例、女17例）。所有受试者均无龋齿或龋齿已充填，无牙周或黏膜疾病，无家族遗传病，3个月内未服用抗生素或引起牙龈增生的药物，并经本人同意后加入本实验。

1.3牙龈炎症指数测定

使用钝头牙周探针，牙龈检查由同一位临床医师完成。检查所有受试者同一牙的牙龈炎症指数（gingivitis index，GI）为该受检者的牙龈炎症指数，其分级标准如下：（GI 0）0级为牙龈正

常，无炎症或出血；（GI Ⅰ）Ⅰ级为轻度炎症，牙龈有轻度颜色改变并轻度水肿、探诊不出血；（GI Ⅱ）Ⅱ级为中度炎症，牙龈颜色发红，水肿光亮、探诊出血。

1.4细菌检测

1.4.1标本采集无菌纸尖法采集所有受试者的龈沟液标本，受试者常规清水漱口后，生理盐水冲洗去除食物残渣，棉卷隔离取样牙，选取同一牙位，吹干牙面，将无菌纸尖插入龈沟内，停留10～30 s取出，置入装有1.5 mL生理盐水的无菌EP管中，-20 ℃保存待测，所有检查和操作均由同一检查者完成。

1.4.2标本DNA提取标本溶解，离心（2 min，12 000 r·min-1，最大离心半径为6 cm），弃上清，于沉淀中加200 µL裂解缓冲液，震荡混匀，100 ℃水浴10 min，再离心（12 000 r·min-1，2 min），取上清150 µL作为模板，于-20 ℃保存。

1.4.3 PCR扩增反应 分别设计P.gingivalis 16S rDNA、Kgp的特异性引物［2］。P.gingivalis引物序列中，F：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’，R：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’，片段大小404 bp，退火温度57 ℃。Kgp引物序列中，F：5’-GAACTGACGAACATCATTG-3’，R：5’-GCTGGCATTAGCAACACCTG-3’，片段大小870 bp，退火温度58 ℃。10×TransStart Taq Buffer 2.5 µL，引物各1.0 µL，TransStart Taq DNA Polymerase 0.5 µL，dNTPs 2 µL，模板DNA 10 µL，用无菌双蒸水补充至总体积25 µL。循环条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（33个循环），最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。Kgp循环条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（33个循环），最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4.4PCR检测首先以16S rDNA为引物，标准菌株DNA为模板，P.gingivalis ATCC33277和P.gingivalis W83菌株做阳性对照；伴放线嗜血杆菌ATCC29522和具核梭杆菌ATCC25586做阴性对照；无菌双蒸水做空白对照，检测引物的特异性和反应体系的敏感性。然后以16S rDNA为引物，临床标本DNA为模板，用于临床标本检测，确定P.gingivalis阳性的患者；检测结果P.gingivalis阳性患者进一步检测Kgp。

1.4.5 凝胶电泳检测PCR扩增产物分别取PCR扩增产物、染液进行避光染色作为检测样本，将样本分别加入琼脂糖凝胶的样品小槽内；用1.5%琼脂糖凝胶水平电泳，电压100 V、时间20 min后，当溴酚蓝带在凝胶中迁移约2/3时，停止电泳。用Ladder DNA Marker确定产物相对分子质量，电泳凝胶在溴化乙锭中染色后，自动凝胶成像分析仪拍照存图。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，P.gingivalis和Kgp各组间检出率比较用χ2检验；P.gingivalis和Kgp的检出率与牙龈炎症之间的关系用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 16S rDNA PCR技术的特异性和敏感性结果

琼脂糖凝胶电泳结果显示P.gingivalis的两种参考菌株ATCC33277、W83的DNA扩增后均得到清晰的404 bp特异性扩增带，而阴性对照伴放线菌嗜血菌ATCC29522、具核梭杆菌ATCC25586和空白对照未见扩增带（图1），说明该引物具有扩增P.gingivalis的特异性，这种PCR反应体系具有检测P.gingivalis的敏感性。琼脂糖凝胶电泳结果显示，P.gingivalis的两种参考菌株ATCC33277、W83的DNA扩增后均得到清晰的870 bp特异性扩增带，而阴性对照具核梭杆菌ATCC25586和空白对照未见扩增带（图2）。

图1　16S rDNA PCR对P.gingivalis的特异性检测Fig1　 16S rDNA PCR specificity of detection of　P.gingivalis

图2　16S rDNA PCR 对Kgp的特异性检测Fig2　 The specificity of 16S rDNA PCR for Kgp detection

2.2 16S rDNA PCR 检测结果

2.2.1 P.gingivalis的检测结果 PCR扩增产物检测结果见图3，其中阳性对照1和临床标本2、6、8、10均扩增出404 bp特异性扩增带，空白对照9和临床标本3、4、5、7、9以及阴性对照11、12均未见目的条带。

图3　PCR检测临床标本中P.gingivalis的结果Fig3　 The result of PCR in the detection of　P.gingivalis

2.2.2 Kgp的检测结果 PCR扩增产物检测结果见图4，其中阳性对照1和临床标本3、5、6、8、9、10、12、13、14均扩增出870 bp特异性扩增带，空白对照4和临床标本4、7、11以及阴性对照2均未见目的条带。

图4　PCR检测临床标本P.gingivalis阳性中Kgp的结果Fig4　The result of　PCR detection of clinical specimens Kgp

2.2.3P.gingivalis和Kgp检出率与牙龈炎症指数之间的关系 经统计，GI 0级、GIⅠ级和GIⅡ级的P.gingivalis的检出率分别为30.00%、64.00%和87.50%，级间差异明显（P＜0.01）。GI 0级、GIⅠ级和GIⅡ级的Kgp的检出率分别为40.00%、75.00%和85.71%。GIⅠ级与GI 0级间差异具有统计学意义（P＜0.05），GIⅡ级与GI 0级间差异明显（P＜0.01），GIⅡ级和GIⅠ级间差异无统计学意义。

P.gingivalis在GI 0级（50例）检出15例，检出率30.00%，其中Kgp检出6例，检出率40.00%；P.gingivalis在GIⅠ级（25例）检出16例，检出率64.00%，其中Kgp检出12例，检出率75.00%；P.gingivalis在GIⅡ级（32例）检出28例，检出率87.50%，其中Kgp检出24例，检出率85.71%。

由此可以看出，P.gingivalis与Kgp检出率随着牙龈炎症指数的升高而升高，Kgp的检出率随着P.gingivalis检出率的增大而增大。P.gingivalis和Kgp检出率与牙龈炎症指数呈正相关。

3　讨论

有学者发现青春期儿童龈下菌斑与成人在细菌种类上无明显差异。青少年龈炎的发生率日益增高，Alexander［3］认为菌斑在牙龈炎的发生过程起着重要作用。研究［4］报道，美国14～17岁人群中有22%可检测到牙周附着水平的丧失，表明牙周破坏发生很早。P.gingivalis是目前公认的重要牙周致病菌并具有显著的毒力或致病性［5-6］。国内外已有报道P.gingivalis在青春期龈炎中有较高的检出率，且其检出率有随检测方法改进和技术水平提高逐渐增大的趋势。有学者利用多重PCR方法检测龈沟液内P.gingivalis与牙龈状况的研究指出，P.gingivalis作为牙龈炎的优势致病菌，其检出率随牙龈病变程度的增加而升高。本实验选取12～17岁青少年作为研究对象，结果表明，P.gingivalis在牙龈正常者、牙龈炎症指数Ⅰ级组与牙龈炎症指数Ⅱ级组间有显著性差异，P.gingivalis的检出率随着牙龈炎症指数的增加而升高。

研究［7］表明，在任一年龄组的儿童中均有P.gingivalis的一过性定植，而进入青春期后P.gingivalis的定植趋于稳定。P.gingivalis在儿童中的总体检出率与成人相似，牙周正常者中也可检测到P.gingivalis。研究［1］表明，P.gingivalis的多种毒力因子参与疾病的发生发展；其中，Kgp是最有潜能的纤维蛋白降解酶，参与病变牙龈的出血及与P.gingivalis有关的持续炎症，在牙周疾病的致病性中起重要作用。Ozmeriç等［8］指出，人的血红素包括l1个Lys残基存在于a、b链，有3个Arg残基存在于a、b链，所以是Kgp蛋白酶的首选底物，表明Kgp蛋白酶在P.gingivalis血色素的黏结和亚铁血红素聚集上起重要作用，因此Kgp也可在牙龈正常个体中表达。本实验中牙龈正常者中Kgp的检出率为40.00%，亦证明此观点。

Kgp能够影响细菌的定植和生存、侵袭，破坏组织并且破坏宿主的免疫防御机制。牙龈炎症组的Kgp比正常组明显升高，有统计学意义；牙龈炎症指数Ⅱ级组Kgp检出率比牙龈炎症指数Ⅰ级组高，但没有明显的差异。Kgp的检出率依照炎症程度的增大而增加，检测值最高的也是炎症严重的组。本研究发现Kgp的检出数与青春期龈炎牙龈炎症指数有显著正相关关系，证明了Kgp与青春期龈炎的严重程度有密切关系。文献报道有两种Kgp基因分型方法，Beikler等［2］首次用限制性内切酶方法研究了牙周炎患者中不同Kgp基因型的发生率，结果显示两种Kgp基因型的发生率差异无统计学意义。特异性的Kgp基因型在患病个体中的检出率远高于健康个体。本研究结果未发现青春期龈炎的Kgp在牙龈炎症指数Ⅰ级组与牙龈炎症指数Ⅱ级组之间有显著性差异，可能与Kgp不同分型的表达有关，也可能与实验中被检人群的身体状况、所检部位、取样方法、样本量较小以及采用的检测方法等不一有关。

综上所述，有必要检测青少年龈沟液内Kgp不同基因型的变化和致病性，早期预防牙龈炎症反应，防止发生不可逆性牙周损害。

4　参考文献

［1］Imamura T.The role of gingipains in the pathogenesis of periodontal disease［J］.J Periodontol，2003，74（1）：111-118.

［2］Beikler T，Peters U，Ehmke B，et al.Sequence analysis of Kgp in Porphyromonas gingivalis isolates from periodontitis patients［J］.Oral Microbiol Immunol，2003，18（6）：393-397.

［3］Alexander SA.Effects of orthodontic attachments on the gingival health of permanent second molars［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，1991，100（4）：337-340.

［4］Bhat M.Periodontal health of 14-17-year-old US schoolchildren［J］.J Public Health Dent，1991，51（1）：5-11.

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［8］Ozmeriç N，Preus NR，Olsen I.Genetic diversity of Porphyromonas gingivalis and its possible importance to pathogenicity［J］.Acta Odontol Scand，2000，58（4）：183-187.

（本文编辑骆筱秋）

Influence of Porphyromonas gingivalis and its gingipain K in healthy gingiva of teenagers

Han Zhiqiang1，Bai Yang2，Xiao Shuiqing1，Sun Fei3，He Ping1.（1.Jinan Stomatological Hospital，Jinan 250001，China；2.Dept.of Stomatology，The First People’s Hospital of Jinan，Jinan 250000，China；3.Dept.of Orthodontics，Hospital of Stomatology，Binzhou Medical University，Binzhou 256603，China）

［Abstract］ObjectiveTo explore the relationship of Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis），gingipain K（Kgp） and puberty gingivitis in the subgingival.MethodsSubjects（12- to 17-year-old children） included 50，25，and 32 periodontally healthy，puberty gingivitis indexⅠ，and puberty gingivitis index Ⅱ children，respectively.16S rDNA PCR was conducted to detect P.gingivalis and Kgp from the samples.Chi-square test was performed to compare the prevalence of Kgp and P.gingivalis in the three groups.Spearman correlation analysis was also employed to evaluate the relationship between the relative quantity of Kgp and periodontal parameters.ResultsP.gingivalis in the puberty gingivitis index Ⅱ group was higher than that in the periodontally healthy group.Puberty gingivitis index Ⅱ was higher than puberty gingivitis index Ⅰ and periodontally healthy groups.Puberty gingivitis index Ⅱ，puberty gingivitis index Ⅱ，and periodontally healthy groups were significantly different from one another（P＜0.01）.Puberty gingivitis index Ⅰ was also significantly different from puberty gingivitis index Ⅱ（P＜0.05）.Kgp in the puberty gingivitis index Ⅰ group is higher than that in the periodontally healthy group（P＜0.01）.Puberty gingivitis index Ⅱ is higher than puberty gingivitis index Ⅰ and periodontally healthy groups.Puberty gingivitis index Ⅰ（P＜0.05） and puberty gingivitis index Ⅱ（P＜0.01） are significantly different from the periodontally healthy group.P.gingivalis and Kgp detection rates increased in the gingivitis index.ConclusionKgp and P.gingivalis are closely related to puberty gingivitis in the subgingival.

［Key words］teenagers；Porphyromonas gingivalis；gingipain K；gingivitis

［收稿日期］2016-01-02；［修回日期］2016-02-22

［作者简介］韩志强，硕士，Email：826964972@qq.com

［通信作者］何萍，主治医师，学士，Email：shqxiao@126.com

［中图分类号］R 788

［文献标志码］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.007