细胞凋亡相关因子与急性呼吸窘迫综合征的研究进展

林锦明，张兴毅

(1.遵义医学院第五附属(珠海)医院急诊科，广东 珠海 519100；2.遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519100)

细胞凋亡相关因子与急性呼吸窘迫综合征的研究进展

林锦明1，张兴毅2

(1.遵义医学院第五附属(珠海)医院急诊科，广东 珠海 519100；2.遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519100)

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发病机制尚不明确，可能与炎症反应、氧化/抗氧化失调有关。细胞凋亡逐渐成为本学科研究的重点。细胞凋亡的调控主要是Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白，通过检测ARDS患者体内相关蛋白的表达，可以对其发病机制进行研究和探讨。本文查阅相关文献，从Bcl-2及其同源体促凋亡的Bax基因及凋亡通路因子Caspase-3进行综述，阐明与ARDS的相互关系。

细胞凋亡因子；急性呼吸窘迫综合征；进展

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)常发生于严重创伤、感染以及休克后，以呼吸频数、窘迫和进行性低氧血症为主要临床表现，其临床死亡率可达32%～55%[1]。目前对于本病的发生机制尚不明确，多数学者认为本病的发生可能与炎症反应、氧化/抗氧化失调有密切关系。但随着研究的不断深入，人们发现细胞凋亡在本病的发生和发展过程中似乎扮演着更加关键的角色，并逐渐成为本学科研究的重点之所在。众所周知，细胞凋亡(Apoptosis)是由多种基因控制的一种自主的细胞程序性死亡，是机体维持内环境稳定的一个主动过程。细胞凋亡规律一旦发生改变，个体可能会出现发育异常、畸变甚至死亡，因此其与许多疾病(如肿瘤、内分泌紊乱)的发生关系密切[2-3]。人体内细胞凋亡的过程是由多种因子通过不同机制共同调控的结果，目前发现以下三种细胞因子与ARDS有关。

1 抑凋亡细胞因子Bcl-2

1.1 Bcl-2概述 Bcl-2基因亦称B细胞淋巴瘤-2基因，是最初在非何杰金淋巴瘤滤泡性的B细胞淋巴瘤中被分离出的一个原癌基因，它因14号和18号染色体易位而激活。这样的易位导致细胞内Bcl-2产生过度表达，表达的基因负责编码一个质量为25～26 kD的蛋白，即Bcl-2蛋白。Bcl-2蛋白的C末端由疏水氨基酸组成一个可以延伸的链状结构，此结构可以插入细胞的膜状结构中，其链状结构的特点与Bcl-2蛋白调节细胞凋亡的能力和方式有着密切关系。Bcl-2蛋白的N端的跨膜区在抑制细胞凋亡中发挥作用[4]。当今研究表明，Bcl-2是一种主要分布于核膜、线粒体外膜和内质网膜的膜结合蛋白，其控制基因位于18q21。Bcl-2基因的研究是通过与B细胞相关的肿瘤中进行的，人们发现在当染色体t(14；18)易位时，Bcl-2表达明显升高，肿瘤细胞产生相对增多，从而认为Bcl-2可能与肿瘤细胞的产生有着密切的关系。随着研究的不断深入，人们发现Bcl-2不仅仅与肿瘤的发生和发展有关，同时与正常细胞的凋亡也有关系。现已证明，Bcl-2可以通过多种途径参与细胞凋亡过程，它也是多种细胞凋亡调节的关键性因子，它的高表达往往可以阻止正常细胞的凋亡程序的启动，从而延长细胞寿命[5-6]。

1.2 Bcl-2抑制细胞凋亡机制 目前对于Bcl-2抑制细胞凋亡的生理机制，尚未完全阐明，但当前研究显示其可能通过以下三个方面对细胞的凋亡产生作用[7]：①众所周知，在细胞凋亡的过程中，反应性氧自由基损伤是其发生的一个重要启动环节，而Bcl-2具有阻断体内氧自由基启动细胞凋亡程序和抗氧化的作用，也正是基于此作用，Bcl-2对细胞凋亡起到一定的调控作用。②位于核膜上的Bcl-2蛋白具有阻断Ca2+从内质网释放的作用。在细胞的凋亡过程中，需要消化相关的核酸内切酶参与，而核酸内切酶的活化需要Ca2+的参与才能完成。位于核膜上的Bcl-2蛋白多数集中在核孔复合体区域，因此它与核膜内外的物质转运、核膜装配以及核孔复合体的形成密切相关，若其阻断Ca2+从细胞外向细胞内转移这一过程，那么细胞凋亡程序则无从启动，从而起到抑制细胞凋亡的作用。③人们发现，在细胞凋亡的过程后，细胞内细胞色素C减少，而线粒体内细胞色素C增加。Bcl-2可以通过影响线粒体释放细胞色素C来调节凋亡过程。转染Bcl-2可以抑制多种因素诱导的肿瘤细胞的凋亡[8]。例如，转染Bcl-2能够抑制三尖杉酯碱引起的白血病细胞凋亡。还有，在肝癌细胞内转染Bcl-2也可以抑制抗Fas单克隆抗体联合TGF-β引起的肝癌细胞凋亡。研究表明，对Bcl-2进行点突变，将缬氨酸或谷氨酸取代BH1位点的第145位甘氨酸,以缬氨酸取代BH2位点的第155位色氨酸。其表达的Bcl-2蛋白酶失去了原来对放射线或糖皮质激素引起的细胞凋亡的抑制能力，并且它也不可以与Bax形成异源的二聚体。也有研究发现，转染Bcl-2的反义寡核苷酸能约束肿瘤细胞的Bcl-2的活性，从而促进多种肿瘤细胞的凋亡。有学者将Bcl-2的反义寡核苷酸导入急性髓系的白血病细胞中，结果发现转染后肿瘤细胞的细胞凋亡率较原来明显降低，并且其细胞对多种化疗药物的敏感性有所升高。

1.3 Bcl-2与ARDS 目前认为ARDS的基本病理基础可能是肺泡-毛细血管膜广泛损伤，从而导致肺水肿和微肺不张。在此过程中，肺泡上皮和肺血管内皮细胞是呈进行性凋亡状态，而这种凋亡方式可能与炎症介导有一定的关系，Bcl-2蛋白的表达与炎症、凋亡密切相关，两者之间似乎存在一定的联系，但目前多数研究主要是在体外和动物模型中进行，很少有人在人体中进行观察。宋勇等[9]在急性期死亡ARDS患者肺脏组织进行研究，结果发现ARDS急性期肺组织细胞凋亡率显著增加，Bcl-2蛋白表达信号较弱，上述结果不但证实了细胞凋亡是在ARDS中广泛存在，同时提示抑制细胞凋亡因子Bcl-2的低表达，可能是导致本疾病呈进行性发展的主要原因。

2 促凋亡因子Bax

2.1 Bax概述 Bax定位于细胞浆，也属于Bcl-2家族成员之一，是Bcl-2家族中被研究最广泛的促凋亡因子，其自身可以形成同源二聚体，也可以与Bcl-2形成异源的二聚体，其所表达的Bax蛋白与Bcl-2蛋白具有21%的同源性[10]。转染Bax不仅能引起许多细胞自发凋亡，而且能够促进多种因素引起的多种细胞凋亡。研究表明，转染Bax反义寡核苷酸可以延长细胞的生存周期。而在利用Bcl-2基因表达的蛋白产物Bcl-2特异性单克隆抗体上，有学者从人和鼠B淋巴细胞中进行蛋白提取，从而发现Bax(即Bcl-2 associated X protein)[11-12]。随着研究的不断深入，Bax的结构也逐渐被人所认识了解，这是一种由192个氨基酸组成，在C’端存在一个具有疏水性的氨基酸，同时在整个蛋白中还含有能够进行磷酸化的7个丝氨酸/苏氨酸残基。利用PCR技术，研究人员发现Bax基因是位于染色体19q13.3～13q13.4上，大小约为45 kB，总共含有6个能够进行蛋白编码的外显子，能够选择性的编码3种不同蛋白质：Bax2α、Bax2和Bax2β。

2.2 Bax促细胞凋亡机制 目前Bax促细胞凋亡的具体机制尚不明确，但随着对Bax基因的研究，人们似乎可以窥其一角。在Bax基因的编码区，含有BH1、BH2和BH3三个保守区域，该三个区域与Bcl-2蛋白具有高度同源性，也是Bax自身或与其他的Bcl-2家族成员结合形成同型或异型的二聚体，是参与细胞凋亡调节的基础。实验研究显示，Bax分子中BH3与Bcl-2形成杂二聚体是促进细胞凋亡必要条件[13]，其中BH3区域对Bcl-2等抗凋亡蛋白具有明显的拮抗作用[14]。同时还有研究显示，Bax作为Bcl-2的同源体，可以与Bcl-2结合，形成一对可以正负调节的异型二聚体，因此两者的比例决定了细胞生存还是凋亡，如果Bcl-2与Bax表达平衡，形成的异型/同型二聚体处于均衡状态，从而细胞可以正常的发育生长；假如Bcl-2表达相对增多，则形成Bcl-2/Bax异型二聚体较多，抑制细胞凋亡，导致细胞生存周期明显延长；同理，若Bcl-2表达相对减少，则可能形成Bax/Bax同型二聚体较多，则细胞凋亡过程明显加快，导致细胞生存周期缩短；根据上述情况，Bcl-2/Bax蛋白之间的比例是细胞凋亡或者存活的关键因素[9]。有学者发现，许多因素在引起肿瘤细胞凋亡的同时常伴有Bax表达升高，显示Bax表达升高与肿瘤细胞的凋亡有密切关联[15-16]。转染Bax到肿瘤细胞后能促进多种肿瘤细胞的凋亡，有研究人员将Bax导入鳞状细胞癌细胞中,显示转染Bax的肿瘤细胞对化疗敏感性显著加强。使用基因技术将Bax通过皮肤导入小鼠体内后，能够使耐药的鳞状细胞癌生长速度较对照组延缓。也有研究将Bax和Bcl-2分别转染至白血病细胞后，其转染Bax的细胞凋亡率会显著增加,并且对化疗的敏感性明显增强。Kagawa等[17]提示转染Bax后能显著抑制肺癌细胞的凋亡，此结果与其是否表达p53是没有显著相关性的。目前Bax已经在体内外水平上广泛地用于黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌等肿瘤的基因治疗研究。

2.3 Bax与ARDS Guinee等[18]的研究发现，在弥漫性肺泡损伤的患者中，其肺组织Bax蛋白的表达显著性增高。在对14例ARDS患者死亡后肺组织采用TUNEL法以及免疫组化技术分析[9]，结果发现Bax在ARDS急性期患者肺组织中表达显著上调，并且Bax表达的增加与肺组织细胞凋亡增加呈平行关系，而此时Bcl-2蛋白的表达并未增加。Kiyonari等[19]采用TUNEL法和免疫细胞化学双染观察到TUNEL染色较强的肺组织中，Bax含量也显著增加，提示Bax与ARDS患者中细胞凋亡存在显著相关性。

3 半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)

3.1 Caspase-3概述 1994年Fernandez-Alnemri等利用RT-PCR技术在BenBank的表达序列标记的数据库中获得一段IL-1b转化酶(ICE)/人美丽线虫凋亡基因(CED-3)活性中心同源的序列，将其合成探针后，筛选人外周血白血病T淋巴细胞的cDNA文库，从中克隆获得一种新基因，它是一个编码分子量为32 kD的半胱氨酸蛋白酶，因此将其称为CPP32(Cysteine protease protein，32 kD)。两周后，另一实验室的学者也独立地将这一蛋白基因克隆出来，这些学者分别将其命名为凋亡素(Apopain)、死亡之神蛋白(Yama Protein)和prICE。直至1996年这种蛋白酶才被统一命名为Caspase-3。Caspase-3是Caspase酶系家族中的重要一员，Caspase家族属于半胱氨酸氨基酸基-特异性蛋白酶[20-22]。Caspase-3前体含有277个氨基酸残基，与ICE及CED-3有30%及35%的同源性，Caspase-3相对分子质量为12.3×103，存在于细胞线粒体中，是组成呼吸链的重要部分[23-25]。目前研究发现，Caspase-3具有双重功能，首先它参与了线粒体进行氧化呼吸，起到传递电子的作用。其次，现代研究认为Caspase-3在细胞凋亡过程中有着不可替代的作用，因为它具有调节细胞凋亡的作用，是细胞凋亡中关键的终末剪切酶；也是CTL细胞杀伤机制中主要的组成部分。

3.2 Caspase-3促细胞凋亡机制 由于Caspase家族蛋白酶均参与了细胞凋亡，而且是其中的关键因子，故也被称为死亡蛋白酶。在已经发现的家族成员中，Caspase-3蛋白是位于细胞凋亡有序级联反应的下游，它最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶，此酶参与DNA修复、基因完整性的监护，因而Caspase-3蛋白是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一；在细胞凋亡过程中，Caspase-3蛋白是多种细胞凋亡刺激信号传递的汇聚点，是凋亡通路的关键执行者。因此，现代研究认为Caspase-3蛋白酶的活化是细胞凋亡进入不可逆转的阶段性标志。正常细胞中，Caspase-3是以无活性的酶原形式存在的，当受到炎症或者其他病理性因素的刺激时，其天冬氨酸残基位点的蛋白被水解导致激活，从而引发系列Caspase酶级联反应，最终启动细胞凋亡。Tian等[26]对鼠纹状体细胞凋亡研究发现，戊二酸可以促进Caspase-3前体蛋白(Pro-caspase-3)的表达和活性增加，继而激活细胞内Caspase-3，导致细胞凋亡发生率明显增加。近年也有学者通过纯化和克隆技术，发现线粒体释放的细胞色素C也可与凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)结合形成多聚体，通过相关反应后，从而激发了Caspase-3等的活性，最终导致细胞发生凋亡。

3.3 Caspase-3与ARDS 目前认为Caspase-3可能主要通过以下三个方面参与ARDS的发生和发展过程中。①直接参与了肺组织细胞的结果破坏。Caspase-3可以剪切LaminA，从而导致核纤层塌陷、细胞核固有形态改变、染色质聚集浓缩。②Caspase-3能够抑制脱氧核糖核酸酶(DNA酶)抑制剂的活性，导致脱氧核糖核酸(DNA)释放增多，直接导致DNA的断裂。③通过改变重要调控蛋白的功能和活性，诱导细胞程序“吃我”信号，从而出现吞噬。在大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤中，Caspase-3蛋白酶表达早期出现升高，48 h后达到峰值[27]，这结果与ARDS肺组织病理损害的进程相符合，表明此时的急性肺损伤与Caspase-3蛋白表达升高是有着密切关联的。

4 小 结

随着分子生物学的不断进展，人们对细胞凋亡与ARDS之间关系的深入研究，发现细胞凋亡可能是预防，甚至是治疗ARDS的新手段和方式。核因子-κB的特异性抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对脂多糖(LPS)所致的急性肺损伤具有较好的调控作用，其中的机制可能与PDTC抑制了凋亡细胞因子的表达、增加了抗凋亡细胞因子的表达有关。这无疑对ARDS的治疗提供了新的方法和方式，值得广大临床工作者进行进一步的系统研究。

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Correlation between apoptosis-related factor and acute respiratory distress syndrome.

LIN Jin-ming1,ZHANG Xing-yi2.1.The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zhuhai 519100,Guangdong,CHINA;2.Zhuhai Campus,Zunyi Medical College,Zhuhai 519100,Guangdong,CHINA

The pathogenesis of acute respiratory distress syndrome(ARDS)is still not clear,which may be related to inflammation,oxidative/antioxidant imbalance.Cell apoptosis has now become the research focus in this field, mainly regulated by Bcl-2,Bax,Caspase-3 protein.Detecting the expression of the apoptosis-related factors in ARDS patients is of great significance to the study of pathogenesis.This paper would illustrate the correlation between apoptosis-related factors and ARDS,including apoptosis-inhibiting gene Bcl-2,apoptosis-enhancing gene Bax,and apoptosis pathway factor Caspase-3.

Apoptosis-related factor;Acute respiratory distress syndrome(ARDS);Progress

R56

A

1003—6350（2016）12—1990—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.031

2015-10-10)

张兴毅。E-mail：754213771@qq.com