一种新型结核分枝杆菌检测方法的研究

黄国清，蔡长争，何树泉，胡波，邬艳波，蔡芬兰，舒少为

(1.深圳市龙华新区中心医院检验科，广东 深圳 518110；2.中山大学附属第三医院检验科，广东 广州 510630)

一种新型结核分枝杆菌检测方法的研究

黄国清1，蔡长争1，何树泉1，胡波2，邬艳波1，蔡芬兰1，舒少为1

(1.深圳市龙华新区中心医院检验科，广东 深圳 518110；2.中山大学附属第三医院检验科，广东 广州 510630)

目的 探讨利用荧光量子点(QDs)开发新一代结核分枝杆菌的检测方法。方法采用特异性多克隆抗体偶联到磁珠上用于结核杆菌的分离和富集，然后用标记QDs的链霉亲和素检测结合生物素标记的肝素血凝素(HBHA)单克隆抗体的结核杆菌。采用牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌作为阳性样品，以大肠杆菌和沙门氏菌作为阴性对照，以评估该方法的可行性。结果用抗酸染色能检测到磁珠分离和富集的结核杆菌，直接观察没有发现阴性对照有荧光，但阳性对照可以观察到荧光。直接观察法的检测限为104细菌/mL。当采用荧光光度计检测样品时，其检测限可以达到103细菌/mL。结论该方法能适用于包括结核分枝杆菌病原体的检测，是一种具有前景的病原体的检测方法。

荧光量子点；结核分枝杆菌；检测

结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自1985年以来结核病疫情在全球范围内急剧上升，据世界卫生组织(WHO)报道，目前全球有近1/3的人，即20亿人口感染了结核杆菌，其中活动性肺结核患者约2 000万，每年新增结核患者800～1 000万，每年约有300万人死于结核病[1-3]。我国是全球22个结核病高发国家之一，活动性肺结核患者数居世界第二位[4]。近年来由于免疫缺陷性疾病，如人免疫缺陷性病毒(HIV)的感染、肿瘤患者和营养不良者的增多，以及多药耐受的结核分枝杆菌的出现，结核患者的人数呈上升趋势。结核分枝杆菌的检测对于结核患者的早期诊断、治疗进程的监控以及流行病学调查有着重要的意义。目前常规结核分枝杆菌的检测，一般采用痰涂片检测、金标准的固体和液体培养、结核菌素试验和分子诊断等方法，但均因存在灵敏度和特异性较低，费时或价钱昂贵等缺陷，难以完全满足临床实际的需要，为及时而准确地对结核患者进行诊断和治疗，开发新型的结核分枝杆菌检测试剂盒已成为亟待解决的问题。随着纳米生物材料和纳米技术的发展，功能化的磁珠可以用于对结核分枝杆菌的分离和富集，荧光量子点由于具有较有机荧光素优越的许多独特的光学特性，如其发射峰波长可由组成材料和粒径大小来调节,其激发光波长范围很宽,具有较大的斯托克位移和狭窄对称的荧光谱峰，从而具备了一元激发、多元发射的特点,且稳定性远高于有机染料，适合于体内和体外对病原体和其他目标分子的检测。

在本研究中，我们用磁珠表面耦联抗结核分枝杆菌属特异性抗体用于结核分枝杆菌的分离和富集，然后用生物素化的抗-HBHA单抗，再用结合链霉亲和素的的荧光量子点(QDs)进行检测，用牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌作为阳性样品和以大肠杆菌和沙门氏菌为阴性对照对该方法进行评价并研究其检测限。

1 材料与方法

1.1 抗体 本研究中所用的抗体包括抗结核分枝杆菌肝素-结合血凝素(Heparin-binding hemagglutinin，HBHA)单克隆抗体(Santa Cruz公司)。生物素标记的抗结核分枝杆菌PPD的兔多克隆抗体(南京金斯瑞生物科技有限公司)，生物素标记的抗羊抗小鼠的多克隆抗体(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.2 抗结核菌抗体与免疫磁珠(MBs)的结合 用上面提到的生物素标记的多克隆抗体功能化结合链霉亲和素包被的MBs。为了这个目的，40 mg抗体加到200 mL(10 mg/mL)的MBs，在室温下孵育30 min。除去没有结合的抗体，在磁场的作用下用磷酸盐缓冲液(PBS)洗5次结合的MBs(Dynal MPC-s,Invitrogen，CA，USA)，溶解在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中。

1.3 链霉亲和素的QDs的功能化 CeSe QDs (15～20 nm)，其最大发射波长为655 nm，用ZnS为其外壳，和含一个羧基的多聚体(Q21321MP，Invitrogen，USA)。在按照说明书操作前，用链霉亲和素包被。简单地说，50 ml的QDs稀释到400 mL的硼酸盐缓冲液(10 mmol/L，pH 7.4)中，96 mL的链霉亲和素溶液(10 mg/mL，Invitrogen，CA，USA)和11.4 mL的EDC (10 mg/mL，Sigma-Aldrich，MO，USA)，室温下孵育90 min。链霉亲和素包被的QDs用500 ml的硼酸缓冲液(50 mmol/L，pH 8.3)洗5次，然后溶解到50 mmol/L硼酸盐(pH 8.3)缓冲液，至终体积为500 mL。

1.4 细菌菌株 为了评估，我们用牛结核杆菌(Pasteur)和结核分枝杆菌(n=3)作为阳性对照，这些菌株生长在Middlebrook 7H11(BD，USA)(含有OADC (油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶)、0.4%丙酮酸(Sigma-Aldrich，Germany)。阴性对照为大肠杆菌(E. coli，n=2)和沙门氏菌(Salmonella，n=4)，这些阴性对照细菌在脑心浸液琼脂培养基(Oxoid，UK)上培养24 h。

1.5 检测限 为了评估每种方法的检测限(Limit of detection，LOD)，我们用2份牛结核杆菌BCG溶液。系列稀释后，用标准的细菌学技术确定其范围为108～10细菌/mL。简单描述如下，几个长在固体培养基上的克隆悬浮在含PBS和6个玻璃珠的无菌旋盖瓶中。为了使大块的细菌团分散，悬液用漩涡器混合几秒钟，然后放置5 min。悬液中细菌的数量用浊度计比色确定。LOD定义为能与阴性对照差异具有统计学意义的最低浓度。

1.6 细菌检测 实验的原理是基于用属特异的多克隆和小鼠单克隆生物素化的抗体耦联MBs分离细菌，最终用链霉亲和素结合的QDs检测荧光信号(图1)。为了这个目的，1 mL每个稀释度的细菌，组成为阳性和阴性对照或等体积的PBS-BSA(0.1%)空白，首先用结合MBs的属特异多克隆抗体40 μL，然后加入1 μg(每个500 ng)HBHA单克隆抗体，然后1 μL(0.2 mg/mL)抗小鼠的生物素化的抗体(南京金斯瑞生物科技有限公司)，最后加入链霉亲和素包被的QDs 4 μL。对于每个杂交步骤，稀释液在37℃轻微震荡20 min，在磁场作用下分离，用PBS-BSA(0.1%)。为了直接观察荧光，样品在UV灯(312 nm)下观察，荧光强度也可以用荧光光度计(Infinite M200，Tecan USA)检测。

图1 细菌的检测原理

2 结 果

2.1 抗结核杆菌抗体和MBs的结合 抗体和纳米粒结合前后用分光光度计在280 nm检测抗体是否和MBs的表面结合。进一步证实有抗体结合或无抗体结合后分离结核杆菌后采用抗酸染色是否MBs和抗体有结合(图2)。与抗体结合的结核杆菌通过磁珠分离后染色阳性，但没有结合抗体的结核杆菌通过磁珠分离没有得到结核杆菌，因此，染色结果为阴性。

2.2 结核杆菌的检测/检测限 图3表明空白和阴性对照没有观察到荧光信号，而结核分枝杆菌可以在检测限之上观察到阳性。在本研究中，LOD被定义为104细菌/mL，即实验管能观察到荧光。当样品用荧光检测仪时本方法的检测限能进一步减少到103细菌/mL (图4)。为了证明该方法的有效性，对样品(阴性和经过系列稀释的阳性对照)进行涂片后荧光显微镜检测。与结核分枝杆菌阳性和阴性对照比较，磁珠周围有荧光光晕。

图2 结合多克隆抗体的磁珠结合富集结核分枝杆菌后的抗酸染色(×100)

图3 直接荧光灯下观察荧光

图4 荧光光度计对细菌的检测限

3 讨 论

基于CdSe QDs可以检测不同病原的DNA，该方法不易产生错误的结果，因为不需要DNA扩增[5-7]。QDs同样可以用于检测结核杆菌的表面抗原。这种方法在方法学上比较简单，它不需要样品处理，这点不同于需要DNA分离纯化后检测细菌DNA，因此，该方法适合床边检测。此外，使用QDs避免了在免疫检测中使用荧光燃料的缺点，例如快速的光淬灭，较窄的激发广谱和较低的信号强度。

笔者发现结核杆菌通过抗体偶联的MBs分离后，链霉亲和素结合的CdSe QDs能够特异地结合在结核杆菌病原体。该过程操作简便，不需要任何昂贵的设备。采用一个简单的光谱仪允许检测1 000细菌/mL的样品。下一步需要研究用其他蛋白或多个蛋白靶点或更明亮的QDs以提高其检测限。本研究进一步完善后用于临床标本的研究，并与现有的结核杆菌的检测方法进行对比。

本研究使用结核杆菌HBHA抗原，其分子量为28 kD，是一个甲基化表面相关蛋白，能够介导结核杆菌和宿主之间的相互作用。HBHA作为一个非吞噬细胞的粘附因子在结核分枝杆菌肺外播散起重要作用[8-9]。HBHA是一个具有重要意义的免疫反应蛋白和结合的临床指示物[10-11]，因此笔者选择HBHA作为检测靶标。在本研究中，笔者同时采用了结核杆菌的多克隆抗体和单克隆抗体，能够增加检测的特异性，同时也方便对其他表达HNHA的病原体的检测。此外，在研究中使用QDs标记的链酶亲合素，能适合检测结合生物素的样品。

总之，按照本研究的思路，采用不同类型的纳米探针，不需要昂贵的设备，只需要磁性设备和一个荧光灯，可以检测不同病原体DNA和其表面抗原。

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A novel detection method for Mycobacterium tuberculosis.

HUANG Guo-qing1,CAI Chang-zheng1,HE Shu-quan1, HU Bo2,WU Yan-bo1,CAI Fen-lan1,SHU Shao-wei1.1.Department of Laboratory Medicine,Shenzhen Longhua New District Central Hospaital,Shenzhen 518110,Guangdong,CHIAN;2.Department of Laboratory Medicine,the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,Guangdong,CHINA

Objective To develop an assay incorporating cadmium selenide quantum dots(QDs)for the detection of mycobacterial surface antigens.MethodsThe bacterial cells were separated using magnetic beads coupled with genus-specific polyclonal antibodies and monoclonal antibodies for heparin-binding hemagglutinin.These complexes were then detected with anti-mouse biotinylated antibody and finally streptavidin-conjugated QDs which leads to the detection of a fluorescent signal.To evaluate the feasibility of the method,Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis(positive controls),as well as E.coli and Salmonella spp.that constituted the negative controls were applied.ResultsMycobacterium cells could directly be detected using acid-fast staining method after Mycobacterium cells were separated using immunomagnetic beads.The direct observation of negative samples did not reveal fluorescence as opposed to the mycobacteria mentioned above.The minimum detection limit of the assay was defined to 104bacteria/mL, which could be further decreased up to 103bacteria/mL when fluorescence was measured with a spectrofluorometer.ConclusionThe method described here can be easily applied for the pathogens including Mycobacterium tuberculosis, implying that this method has potential application for various different pathogens.

Quantum dots(QDs);Mycobacterium tuberculosis;Detection

R378.91+1

A

1003—6350（2016）07—1048—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.006

2015-11-22)

广东省科技计划项目(编号：2013B090500101)；广东省深圳市龙华新区科技创新资金“社会公益科研项目”(编号：2013092)

胡波。E-mail：hxb1993@sina.com