组织S100Al mRNA和Snail mRNA检测在卵巢疾病中的应用

刘亚红，孙蓓

(陕西中医药大学第二附属医院妇二科，陕西 咸阳 712000)

组织S100Al mRNA和Snail mRNA检测在卵巢疾病中的应用

刘亚红，孙蓓

(陕西中医药大学第二附属医院妇二科，陕西 咸阳 712000)

目的 探讨组织钙结合蛋白S100Al mRNA和锌指转录因子Snail mRNA检测在卵巢疾病中的临床应用。方法选取2013年3月至2015年3月我院经病理确诊的卵巢病变组织标本共68例，通过RT-PCR技术检测卵巢良性囊腺瘤(良性肿瘤组)、交界性囊腺瘤(交界性肿瘤组)和卵巢囊腺癌(卵巢癌组)组织S100Al mRNA和Snail mRNA的表达，并测定各组血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)及人附睾分泌蛋白(HE4)水平，比较三组患者以上指标的变化。结果卵巢癌组组织S100Al mRNA和Snail mRNA的表达量与交界性肿瘤组和良性肿瘤组比较明显增高，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，交界性肿瘤组与良性肿瘤组比较明显增高，差异也有显著统计学意义(P＜0.01)；卵巢癌和交界性肿瘤组S100Al mRNA和Snail mRNA相对表达量具有相关性(r=0.629、0.571，P＜0.01)，组织S100Al mRNA和Snail mRNA分别与血清CA125及HE4呈现相关性(r=0.632、0.587，P＜0.01；r=0.638、0.617，P＜0.01)。结论联合检测组织S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌病变组织中的表达，可增加卵巢囊腺癌的早期检出率，为上皮性卵巢疾病的鉴别诊断提供新的思路。

卵巢良性囊腺瘤；卵巢交界性囊腺瘤；卵巢囊腺癌；S100Al mRNA；Snail mRNA

卵巢上皮性肿瘤是最常见的卵巢肿瘤，占原发性卵巢肿瘤的50%～70%，占卵巢恶性肿瘤的85%～90%[1]。上皮卵巢癌是女性生殖系统的恶性肿瘤之一。卵巢癌早期症状不典型，在普通人群筛查中，无论是卵巢癌首选检测标志物癌胚抗原还是B超都不能够有效诊断[2]。国内外统计资料显示，早期诊断的卵巢癌患者，手术及介入治疗，90%的患者能存活5年以上，而已发生转移的晚期卵巢癌患者5年生存率不足30%[3]。因此提高卵巢癌的早期诊断率，及对卵巢癌全面的术前评估对于卵巢癌治疗处理及预后至关重要[3]。S100Al是钙结合蛋白S100家族的成员，其与多种癌症相关[2]。锌指蛋白Snail是胚胎发育中促进中胚层和神经嵴形成的转录因子。SNAI1通过抑制E-钙黏蛋白的表达诱导上皮间质转化的发生，导致癌细胞丧失上皮特性，富于侵袭和转移特性[4]。本研究用RT-PCR技术检测68例卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌组织中Snail mRNA和S100Al mRNA的表达情况，探讨两个标志物在卵巢癌中表达的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年3月至2015年3月我院经病理确诊的卵巢病变组织标本共68例，患者年龄32～81岁，平均53.5岁。其中卵巢良性肿瘤组织(良性肿瘤组)20例，卵巢囊腺癌(卵巢癌组)30例，交界性囊腺瘤(交界性肿瘤组)18例。每例患者手术过程中均取适量卵巢组织。上皮性卵巢癌按照国际妇产科联盟(FIGO) 2000年分期：I～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期18例；按WHO分化标准：高分化(G1)9例、中、低分化(G2、G3)21例。本研究经本院伦理委员会批准，并得到所有研究对象的知情。

1.2 研究方法 采用RT-PCR方法研究卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌组织中钙结合蛋白S100Al mRNA和锌指转录因子Snail mRNA表达状况，采用酶联免疫吸附反应测定各组血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)及人附睾分泌蛋白4(HE4)水平。

1.2.1 仪器、试剂和引物 RNA提取来自美国Invitrogen公司。lightCycler荧光PCR仪来自德国Roche公司。PCR试剂盒来自上海久盛医疗用品有限公司。

1.2.2 细胞分离和总RNA的提取 采用Trizol法提取组织中的总RNA，在分光光度计上检测A260/280的比值以验证RNA的纯度。

1.2.3 PCR扩增 用Primer5软件设计引物，Snail正义链：5′-AATCGGAAGCCTAACTACAGCG-3′，反义链：5′-GTCCCAGATGAGCATTGGCA-3′，扩增产物大小350 bp。S100Al的引物序列为：正义链5′-CAGGAATTCATGGCCTTTGT-3′，反义链5′-ATGATGCAGGCCGTTAAAAC-3′，产物长度365 bp。β-actin作为内参照，β-actin的引物序列为：正义链5′-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3′，反义链5′-GCCTTCCATCCC TTTGCTTAG-3′；产物长度650 bp。反应条件：95℃，10 min→95℃，30 s→52℃，30 s→72℃，30 s，40个循环→72℃，10 min→4℃保存。

1.2.4 基因片段序列测定和分析 使用测序仪对PCR产物进行序列测定。将测序结果通过BLAST应用软件与GenBank中的已知序列进行同源性比较。

1.2.5 mRNA表达量测定 对扩增目的片段进行凝胶电泳，通过紫外光凝胶成像系统进行扫描并记录，用四维成像处理系统，测定各组的cDNA的特异性，RNA表达量与内参照的比值代表mRNA表达量。S100Al mRNA和Snail mRNA电泳图见图1、图2。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验，相关性分析采用Pearson法，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价组织S100Al mRNA和Snail mRNA的临床意义，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 不同病变组织Snail mRNA表达

图2 不同病变组织S100Al mRNA表达

2 结 果

2.1 血清肿瘤标志物检测结果比较 卵巢癌组中的血清CEA、CA125及HE4水平分别与交界性肿瘤组和良性肿瘤组比较均增高,其差异均有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 各组血清肿瘤标志物检测结果(±s)

表1 各组血清肿瘤标志物检测结果(±s)

注：与良性肿瘤组比较，t=7.82、17.37、21.38，aP＜0.01；t=20.36、43.67、57.32，bP＜0.01；与交界性肿瘤组比较，t=17.53、37.22、47.93，cP＜0.01。

组别 例数CEA(ng/ml)CA125(U/ml)HE4(pmol/L)良性肿瘤组交界性肿瘤组卵巢癌组20 18 30 1.19±1.12 7.28±10.73a32.69±17.58bc12.33±5.71 69.07±170.37a339.7±77.38bc10.09±1.68 83.33±57.56a320.07±37.27bc

2.2 组织S100Al mRNA和Snail mRNA表达率和表达量比较 卵巢癌组两标志物交界性肿瘤组和良性肿瘤组比较明显增高差异有统计学意义(P＜0.01)，交界性肿瘤组与良性肿瘤组比较也增高，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表2。

表2 各组组织S100AlmRNA和SnailmRNA表达量比较(±s)

表2 各组组织S100AlmRNA和SnailmRNA表达量比较(±s)

注：与良性肿瘤组比较，t=12.39、10.67，aP＜0.01；t=33.62、32.57，bP＜0.01；与交界性肿瘤组比较，t=29.61、27.73，cP＜0.01。

组别 例数Snail mRNA S100Al mRNA良性肿瘤组交界性肿瘤组卵巢癌组20 18 30 0.26±0.06 0.43±0.08a1.13±0.14bc0.21±0.05 0.37±0.07a1.06±0.12bc

2.3 相关性分析 S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢癌和交界性肿瘤组织中的表达量具有相关性(r=0.629、0.571，P＜0.01)。在卵巢癌和交界性肿瘤组织S100Al mRNA和Snail mRNA表达量与血清CA125及HE4水平有明显相关性(r=0.632、0.587，P＜0.01；r= 0.638，0.617，P＜0.01)。

2.4 利用ROC曲线来评价两项标志物的价值 卵巢癌组以交界性肿瘤组为参照，组织S100Al mRNA和Snail mRNA的AUC分别为0.803，0.768，P＜0.01，联合检测组织S100Al mRNA和Snail mRNA的AUC为0.953，P＜0.01，即组织S100Al mRNA和Snail mRNA在鉴别卵巢癌和卵巢交界性肿瘤疾病中有诊断意义。单独检测组织S100Al mRNA和Snail mRNA分别用于诊断交界性肿瘤时，以对照组为参照的AUC分别为0.537、0.607，P＜0.01，联合检测两标志物的AUC为0.783，P＜0.01。即组织S100Al mRNA和Snail mRNA在鉴别卵巢交界性肿瘤和良性肿瘤疾病中有诊断意义，见图3～图6。

图3 检测S100Al mRNA和Snail mRNA诊断卵巢癌和卵巢交界性肿瘤的ROC曲线

图4 联合检测S100Al mRNA和Snail mRNA诊断卵巢癌和卵巢交界性肿瘤的ROC曲线

图5 检测S100Al mRNA和Snail mRNA诊断卵巢交界性肿瘤和良性肿瘤的ROC曲线

图6 联合检测S100Al mRNA和Snail mRNA诊断卵巢交界性肿瘤和良性肿瘤的ROC曲线

3 讨 论

研究证实，S100Al蛋白在心脏疾病中有着重要作用，其与多种神经病变及多种癌症均相关[2]。Sviatoha等[5]的研究证明，在多种恶性肿瘤中都存在S100Al表达上调的现象，所以，S100A1或许可以作为鉴别良恶性肿瘤组织的标志物。有报道认为，S100A1在正常卵巢组织中的表达较少，但在卵巢癌中的表达明显增高[2]。本研究显示S100A1在卵巢癌组织中呈现高表达，其与交界组和对照组的比较差异有统计学意义(P＜0.01)，推测S100A1的高表达与卵巢癌的发生相关，交界性肿瘤组的S100A1表达低于卵巢癌组(P＜0.01)，提示其在转移和深部浸润等方面的机会较小。进一步研究显示交界组S100A1表达高于对照组(P＜0.01)，提示交界性肿瘤可能存在有低度恶性潜能。S100A1在卵巢癌和交界性肿瘤中的表达差异提示其可作为卵巢癌的早期诊断的分子标志物，S100A1在肿瘤发生过程中的分子机制尚不清楚[6]，这也是我们接下来所要探索的问题，这对肿瘤的诊断和治疗具有非常积极的意义。

近年来Snail在肿瘤发生的作用中越来越受到人们的关注。Parker等[7]研究发现，在预后较差的早期乳腺癌患者的癌细胞中Snail呈现高水平表达，在侵袭性乳腺癌的上皮和内皮细胞中均发现Snail的过表达，而在正常的乳腺中则没有表达。Yokoyama等[8]研究发现，侵袭力强的口腔鳞癌细胞中发现有Snail的高表达，而侵袭力弱的口腔鳞癌细胞中几乎检测不到Snail的表达。有研究采用免疫组织化学检测83例卵巢囊腺瘤、不同分化程度的卵巢癌组织中Snail的表达情况，发现Snail在卵巢癌组织中的表达显著高于卵巢囊腺瘤[9]。本研究通过RT-PCR技术检测不同卵巢组织Snail的表达发现，Snail在卵巢癌组织中的表达显著高于交界性肿瘤组和对照组(P＜0.01)，提示Snail可以作为卵巢癌早期诊断的标志物。Snail表达在交界性肿瘤组和对照组间的差异有统计学意义(P＜0.01)，提示Snail检测可能为卵巢肿瘤的手术治疗提供依据。

S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢癌和卵巢交界性肿瘤组织中的表达量具有相关性(P＜0.01)，在上述两组中S100Al mRNA和Snail mRNA表达量与血清CA125及HE4水平有明显相关性，提示两标志物与卵巢癌的发生和发展密切相关。在卵巢癌和交界性肿瘤这两种疾病的鉴别诊断中有一定的意义。利用ROC曲线评价两标志物的结果显示，组织S100Al和Snail检测在鉴别卵巢癌和卵巢交界性肿瘤疾病中有诊断意义(P＜0.01)。单独检测组织两标志物对鉴别卵巢交界性肿瘤和卵巢良性肿瘤有诊断意义(P＜0.01)。

综上所述，组织S100Al和Snail的检测可应用于上皮性卵巢肿瘤的鉴别诊断，并为卵巢癌的早期发现提供依据。

[1]谢幸,苟文丽.妇产科学[M].8版.北京:人民卫生出版社,2013: 326-327.

[2]牟红新,王婕,张萍.钙结合蛋白S100Al在卵巢癌中的表达及意义[J].中国计划生育学杂志,2013,21(8):524-527.

[3]陈燕,林莺莺,郑瑜宏,等.血清HE4、CA125和ROMA指数评估卵巢癌风险性的初步评价[J].中国免疫学杂志,2013,29(2): 168-174.

[4]Olmeda D1,Moreno-Bueno G,Flores JM,et al.Snail is required for tumor growth and lymph node metastasis of human breast carcinoma DA-MB-231 cells[J].Cancer Res,2007,67(24):11721-11731.

[5]Sviatoha V,Tani E,KIeina R,et al.Immunohistochemical analysis of the S100A1,S100B,CD44 and Bcl-2 antigens and the rate of cell proliferation assessed by Ki-67 antibody,in benign and malignant melanocytic tumours[J].Melanoma Res,2010,20(2):118-125.

[6]翁达飞,章宜芬.钙结合蛋白SIOOAl在肾细胞肿瘤中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2009,17(7):1375-1377.

[7]Parker BS,Argani P,Cook BP,et al.Alterations in vascular gene expression in invasive breast carcinoma[J].Cancer Res,2004,64: 7857-7866.

[8]Yokoyama K,Kamata N,Hayashi E,et al.Reverse correlation of E-cadherin and Snail expression in oral squarnous cell carcinoma cells in vitro[J].Oral Oncd,2001,37(1):65-71.

[9]帅智峰,刘婷,于秀文,等.转录因子SNAI1与卵巢癌组织恶性表型之间的关系[J].中国老年学杂志,2014,34(5):2348-2350.

Application of detecting S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the patients with ovarian diseases.

LIU Ya-hong,SUN Bei.The Second Departerment of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712000,Shaanxi,CHINA

Objective To explore the application of detecting S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the patients with ovarian disease.MethodsA total of tissue specimens from ovarian disease diagnosed by pathological section were selected from March 2013 to March 2015.The expression of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues was detected in the ovarian benign cystic adenoma(benign tumor group),borderline cystic adenoma(borderline tumor group)and ovarian cystadenocarcinoma(ovarian cancer group)by RT-PCR technique,as well as the levels of serum carcino-embryonic antigen(CEA),carbohydrate antigen 125(CA125),and human epididymis secretory protein 4(HE4). The changes of the above indicators were compared among the three groups.ResultsThe expression rates of S100Al mRNA and Snail mRNA were significantly higher in ovarian cancer group than borderline tumor group and the benign tumor group(P＜0.01),and also in borderline tumor group than benign tumor group(P＜0.01).The relative expressions of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues were correlated in the ovarian cancer group and the borderline tumor group (r=0.629,0.571,P＜0.01),and the two markers were correlated with the levels of serum CA-125 and HE4(r=0.632, 0.587,P＜0.01;r=0.638,0.617,P＜0.01).ConclusionJoint detection of expression of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the ovarian benign cystic adenoma,borderline cystic adenoma and ovarian cystadenocarcinoma can increase the early detection rate of ovarian cystadenocarcinoma,providing a new thought for the differential diagnosis of the ovarian diseases.

Ovarian benign cystic adenoma;Borderline cystic adenoma;Ovarian cystadenocarcinoma;S100Al mRNA;Snail mRNA

R711.75

A

1003—6350（2016）07—1051—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.007

2015-09-18)

刘亚红。E-mail：280310216@qq.com