肝性脑病动物模型的研究进展

200032　上海　复旦大学上海医学院(李政)；复旦大学附属中山医院消化科(石虹)



·综述·

肝性脑病动物模型的研究进展

李政石虹

200032上海复旦大学上海医学院(李政)；复旦大学附属中山医院消化科(石虹)

肝性脑病(hepatic encephalopathy, HE)是由肝功能不全和/或门体静脉分流(portal systemic shunting, PSS)所引起的大脑功能障碍，其神经或心理异常表现程度各异，轻者为亚临床改变，重者可发生昏迷[1,2]。HE分为3种类型：A型HE为与急性肝功能衰竭相关的HE；B型HE为单纯门体旁路所引起；C型HE是在慢性肝病患者中发生的HE，患者通常已进展至肝硬化，并建立了较为丰富的门体侧支循环[3]。现就模型建立方法、机制、优缺点和行为学检测等方面对三型HE的常用动物模型作一综述。

一、A型HE动物模型

(一)非肝性动物模型

建模方法可采用肝断流手术或全肝脏切除术。肝断流手术中，肝脏被完整保留，但流入肝脏的血循环被转道(门腔静脉吻合)和阻断(肝动脉结扎)；全肝脏切除术中肝脏被移除，内脏血循环转道[4]。机制为通过切除肝脏或扰乱肝脏的血液循环造成肝功能衰竭。肝切除模型和肝断流模型大鼠均会出现星型胶质细胞足突肿胀，肝断流术后的大鼠脑水肿、血氨升高、颅内压增高、其脑动作电位的表现和急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)患者的表现相似[4]。由于24h死亡率较高，不利于疗效的观察，从而限制了这些模型的应用[5]。

(二)药物诱导模型

1. 硫代乙酰胺(Thioacetamide, TAA)诱导的鼠模型：TAA诱导的ALF大鼠模型最早由Zimmermann等[6]建立。不同文献选用的实验动物、TAA剂量和给药时间有所不同，如Sprague Dawley(SD)大鼠连续4天300 mg/kg腹腔注射[7]，雌性C57BL/6小鼠连续2天300 mg/kg腹腔注射[8]，或小鼠连续3天100 mg/kg腹腔注射[9]等。TAA被肝脏摄取后，经肝细胞内的细胞色素P450混合功能氧化酶代谢为TAA-硫氧化物，引起脂质过氧化反应和肝细胞损伤，并可直接作用于肝细胞DNA、RNA和蛋白质合成酶产生毒性作用，诱导肝代谢紊乱，致肝坏死[5]。TAA制备的HE模型具有良好的可重复性、易操作、成功率高、与人类HE相似度高等优点[10]。

2. 四氯化碳(CCl4)诱导的鼠模型：将CCl4按1∶4体积比溶于矿物油，按2.5 mL/kg剂量给予BALB/c裸鼠腹腔注射[11]。CCl4经肝微粒体细胞色素P450代谢激活, 生成活性自由基及一系列氧化活性物质, 与肝细胞质膜或亚细胞膜脂质发生过氧化反应, 降解膜磷脂, 破坏细胞膜完整性, 使其通透性增加, 致肝细胞坏死[5]。CCl4价格低廉；但实验动物存活率低(24和48 h存活率分别为40%和10%)[12]。

3. D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)诱导的兔子模型：该模型的建立方法为将D-GalN溶于5%浓度的右旋糖溶液，按4.25 mmol/kg的剂量予以雄性新西兰白兔耳静脉注射。星形胶质细胞的损伤和功能受抑制是该模型HE的发生机制[13]。该模型可以重现星型胶质细胞水肿[13]，但实验动物相对较贵。

4. 脂多糖和α-鹅膏蕈碱诱导的猕猴模型：将1 μg/kg脂多糖和0.1 mg/kg α-鹅膏蕈碱溶于50 mL的生理盐水之中，缓慢注射到雌性恒河猴的腹腔中。脂多糖和α-鹅膏蕈碱先引起恒河猴肝细胞脂肪变性，最后发展成肝细胞大片坏死，爆发性肝功能衰竭。恒河猴模型与人类HE有相似的代谢和生理学特点[14]。但价格昂贵；迄今为止研究例数少，缺乏对比。

5. 氧化偶氮甲烷(azoxymethane, AOM)诱导的小鼠模型： 雄性C57Bl/6大鼠腹腔注射100 mg/kg AOM。AOM促进趋化因子配体2(chemokine ligand 2, CCL2)上调，CCL2与肝性脑病小胶质细胞的激活和神经功能下降相关[15]。该模型是研究急性肝损伤和肝性脑病的理想模型，具有可逆性、可重复性、具有治疗窗等；但AOM对人体有生物毒性，实验中还需注意对动物的体温控制[16]。

二、B型HE动物模型

目前常用的建模方法是端-侧门腔静脉吻合术(porta-caval anastomosis, PCA)：结扎门静脉近端，将门静脉和下腔静脉之间进行端-侧吻合[17,18]。门腔静脉分流引起脑组织中氨和谷氨酰胺增高，改变昼夜生物节律，使运动功能、记忆和学习能力减退，反射下降，降低脑的葡萄糖利用率，改变多种神经递质功能[5]。改良的选择性门腔静脉端侧吻合术是将肠系膜上静脉和下腔静脉行端-侧吻合。选择性门腔静脉端-侧吻合术与侧-侧门腔静脉吻合使流入肝脏的门静脉血流全部终止相比，只减少了其中的50%门静脉血流；且术中静脉更易暴露被找到，但为了确保血管不被拉伸和卷曲所花费的手术时间更长[19]。

三、C型HE动物模型

(一)有症状的C型HE模型

1. 药物诱导模型：予以含TAA(初始浓度0.03%)的饮用水喂养Wistar大鼠12周，每周根据大鼠的体质量适当增减TAA的浓度[20]；或20周(浓度0.3 g/L或0.5 g/L)[21]。发病机制是通过改变在注意力和记忆力中起作用的脑边缘系统区的乙酰胆碱脂酶活性[20]。TAA价格低廉；但药物诱导的C型HE模型建模周期较长，建模过程中需注意监控动物体质量，适当增减药物剂量。

2. 手术模型：在麻醉下结扎成年Wistar大鼠肝胆管汇合处以下和胰管开口以上的胆总管处，再将两结扎处之间的胆总管切除[22,23]。胆管结扎(bile duct-ligated, BDL)大鼠大脑皮质中GABA神经递质的合成改变，表现为自主活动的时空特点和探索性活动的改变，和短期识别记忆力的下降[22]。BDL可诱导可重复的胆汁性肝硬化大鼠模型，表现为肝功能衰竭、进行性黄疸、门脉高压、门体分流、细菌移位以及免疫系统功能障碍；该模型大鼠虽然血氨升高，但仅表现为低级别的HE[4]。

3. 药物和手术结合的C型HE模型

(1)BDL并辅以铵盐喂食的大鼠模型：给予BDL术后的SD大鼠连续两周喂食含质量百分比浓度为10%的乙酸铵的食物[24]。大鼠在肝病疾病和炎症介质激活的背景下，氨作为诱发因素，引起严重的行为损伤。大鼠表现出与肝硬化HE患者相似的神经解剖学和神经化学特点，脑水肿和炎症激活可以在这种情况下被发现[25]。

(2)CCl4诱导肝硬化结合门静脉结扎的大鼠模型：SD 雄性大鼠每周予以含CCl4的饮用水灌胃，初始剂量为20 μL，以后每周根据体质量调整剂量，共6周；其后实施门静脉结扎术。大鼠有轻度的脑水肿，肝再生结节和AlzheimerⅡ型星形细胞。该模型大鼠比肝硬化模型大鼠门体分流更明显；同时比门静脉结扎大鼠肝功能异常更明显。能很好地重现肝硬化HE患者的主要症状：门体分流、血氨和脑氨水平增高、轻度脑水肿。缺点在于死亡率较高(67%)[26]。

(二)MHE的模型

1. 药物诱导模型：SD雄性大鼠予以200 mg/kg TAA隔日腹腔注射，共两次，MHE发生率为83.3%[27]；或雄性albino 大鼠予以50 mg/kg TAA腹腔注射，每周两次，共14 d[28]；或SD大鼠予以200 mg/kg TAA腹腔注射，每周两次，连续8周[29]。谷氨酸盐-一氧化氮-环鸟酸苷通路中多巴胺受抑制导致MHE大鼠的记忆受损为其发病机制[29]。需通过脑诱发电位检查是否建模成功[27]。

2. 手术模型：采用门静脉校准狭窄术：雄性Wistar Kyoto大鼠在乙醚麻醉下，予以20号钝针头在门静脉旁引导，用3号丝线结扎门静脉；随后移除针头得到一个校准狭窄的门静脉；通过门静脉校准狭窄术大约能减少门静脉66%的容积。术后10 d发生门静脉高压和高血氨症，不伴有其他明显的中枢神经系统改变，其分子学机制可能与海马线粒体功能障碍和细胞凋亡有关[30]。该模型可以重现MHE高血氨的症状，但需精准地控制门静脉的狭窄度，对于实验者的手术技术要求较高。

四、HE模型行为学检测方法

(一)强制游泳试验实验前1天，大鼠在室温下，被放置在直径24 cm，高50 cm的圆柱桶内，注入30 cm深的水，让大鼠在其中活动10 min，将大鼠从桶中取出，在干净的笼中干燥后放回饲养笼。24 h后，大鼠被再次放置在圆柱筒内，用摄像机监测大鼠5 min的行为，并计算大鼠不运动、游泳或试图爬出圆筒这三项活动每项所用的时间[21]。

(二)新物体识别实验第一天，大鼠被放置在直径80 cm的圆形场地5 min以适应环境。第二天，在同一场地里放置两个相同的物品，让大鼠自由探索2 min。第三天，将其中一个物品替换成不一样的物品，让大鼠自由探索2 min，记录其探索两个物品的时间，并计算探索新物品的时间与探索两个物品时间的比值，比值下降表示其记忆能力受损[21]。

(三)空间参考记忆的Morris水迷宫实验该实验在圆形的水箱中进行。大鼠会经过连续四天的训练，将它们依次放入水中，给予其120 s时间寻找平台，并在平台上停留20 s。第五天，将平台移开，每只大鼠进行四次实验，每次有90 s的时间游泳，在原先平台处停留的平均时间记录为记忆再现指数[28]。

(四)旋转实验每只大鼠将进行每天5轮连续5 d的旋转实验。大鼠被放置在一个转棒装置上，转棒的速度从第一天到第五天分别为5、10、15、20和25 rpm。每轮实验会进行三次，每次间隔10 min，记录三次实验中大鼠在转轮上停留的最长时间[28]。

(五)步态实验大鼠的后爪被涂上墨水，在60 cm×10 cm纸带上从光亮处走向黑暗处，测量并记录左右爪之间的距离[28]。

(六)穿梭箱回避实验大鼠被放置在一个双向的穿梭箱中，内有设备可以产生非条件刺激(unconditioned stimulus, US)和条件刺激(conditioned stimulus, CS,电击后亮灯)。每只大鼠在连续五天中接受五轮测试，每轮测试前，给大鼠5 min适应暗室，随后进行30次试验，每两次间隔(30±5) s。CS中每次电击前有20 s电灯点亮时间。US中，相当于CS的最后10 s时会以0.5 mA电流电击大鼠10 s或至大鼠移动到箱子的另一侧即停止。如果大鼠在CS中受到电击前即移动到箱子另一侧，则此次记录为回避；如果大鼠受到刺激后做出反应，则记录为逃脱；如果大鼠在刺激中不移至另一侧，则记录为无反应。分别记录大鼠回避、逃脱和无反应的次数[28]。

(七)高架十字迷宫实验高架十字迷宫组件由两条相对开放臂(50 cm长×10 cm宽)和两条相对闭合臂(50 cm长×10 cm宽×40 cm高)组成。装置距离地面50 cm高，放置在红光照明的房间正中。大鼠被放在装备的中央，面向开放臂，自由探索5 min。分别记录大鼠进入封闭臂的次数与进入两组臂总次数的比值、于封闭臂处滞留时间与在两组臂处滞留总时间的比值[31]。

(八)动物表现的临床分级评分标准正常行为(0分)，轻度嗜睡(1分)，运动减少、姿势控制困难和疼痛知觉减弱(2分)，严重的共济失调、无自发翻正反射(3分)，无翻正反射、对疼痛刺激无反应(4分)[7]。

五、结语

A型HE模型的建立期望达到如下标准：可复制性，并易于观察分期；症状的进展包括脑水肿及其并发症(颅内高压及脑疝)；潜在的可逆转性；高血氨/脑氨、谷氨酰胺增加；肝脏、脑组织的病理变化具有特征性；对实验人员具有最小的毒性。B和C型HE大鼠模型期望达到的标准为：门体分流或慢性肝病伴门体分流；脑病的症状从轻微型HE到昏迷；脑病昏迷阶段AlzheimerⅡ型星形细胞增生；血氨、脑氨和谷氨酰胺浓度升高；存在诱发因素；对治疗手段有可观察的临床反应[4]。根据研究目的合理选择并进一步完善合适且稳定的HE动物模型对于进一步阐明HE的发病机制和寻求新的治疗方法十分重要。

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(本文编辑：张苗)

(收稿日期：2015-08-31)

通信作者：石虹，Email: shi.hong@zs-hospital.sh.cn

基金项目：国家基础科学人才培养基金项目J1210041 (批准号：NSFC grant J1210041)