母体血清MicroRNAs可作为胎儿先天性心脏病产前检查的非侵入性生物标记物

朱莎莎

母体血清MicroRNAs可作为胎儿先天性心脏病产前检查的非侵入性生物标记物

朱莎莎

目的先天性心脏病是胚胎发育过程中最常见的畸形。本次研究的目的就在于检测母体中血清miRNAs的含量，以及它们与胎儿先天性心脏病的关系。方法提取孕18～22周时的母体血清总RNA，而后运用SOLiD测序和荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）的方法检测母体血清中miRNAs的相对表达量，应用统计学方法计算其灵敏性和特异性。结果发现miR-19b, miR-22，miR-29c和miR-375这4种miRNAs在怀有先天性心脏病胎儿的母体血清中表达显著升高，并且它们作为标记物的曲线下面积（AUC）分别是0.790，0.671，0.767和0.693，能有效发现胎儿先天性心脏病。结论笔者发现并证实了有4种血清miRNAs可以作为胎儿先天性心脏病产前检查的一种关键性的非侵入性生物标记物。

母体血清miRNAs；生物标记物；先天性心脏病

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是指心脏和胸内大血管的结构畸形及其可能导致的功能性异常，是胎儿及新生儿缺陷中最常见的一种。每年约有8‰的新生儿患有CHD[1]，死于CHD的新生儿占新生儿总死亡率的40%，其中20%死于出生后第1个月[2]。因此，早期诊断是减少CHD发病率和死亡率的关键。

miRNA一类生物体内自然生成的小分子非编码RNA，其成熟状态长约19～23个核苷酸，具有高度保守性、含量丰富、结构稳定、易于定量检测、疾病高特异性等特点[3]。最新数据显示心脏组织有其特异性的miRNAs，即这些miRNAs的表达水平与相同组织的正常细胞存在显著差异[4]。有研究表明，心脏源特异的miRNAs和胎盘miRNA的表达呈正相关，且这些胎盘源的miRNA可在母亲外周血中被检测到[5]。

因此我们假设，在孕早期时，我们可以通过检测母体血清中的miRNAs表达来筛查胎儿CHD。首先通过SOLiD测序的方法系统筛查出先天性心脏病胎儿特异表达的miRNAs，而后通过荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）进行验证。

1 材料和方法

1.1 研究设计和样本特点

2015年7月～2016年8月，本研究在苏州大学附属第一医院总共收集了98例病例。其中38例病例因既往有心脏病病史、有心脏病家族史、妊娠期并发症以及多胎妊娠或者胎儿患有唐氏综合征等易导致CHD的疾病等因素被剔除。最终纳入60例符合标准的样本，其中病例组为30例怀有CHD胎儿的母体血清，对照组为30例怀有正常胎儿的母体血清。病例组中胎儿CHD都是通过胎儿心超证实的，30例CHD主要包括室间隔缺损、房间隔缺损和法洛四联症。为了减少影响因素，笔者还匹配了孕妇的年龄和孕周。使用t检验可得，病例组平均年龄（27.74±4.68）岁，平均孕周（20.99±1.29）周，而对照组平均年龄（28.48±1.29）岁，平均孕周（20.20±1.09）周，P＞0.05，两组间差异无统计学意义。本次研究由苏州大学以及苏州大学附属第一医院伦理委员会批准，每个样本的临床信息都来源于产检报告，并在纳入前得到了参与者的同意。

1.2 血清准备和RNA提取

在孕18～22周时采集5 ml母体静脉血。全血在室温静置30 min后，以4 000转/min的转速离心10 min，分离出血清和细胞碎片。分离出的上层血清冷冻在-80℃中储藏待用。

抽吸400 μl血清后用mirVana PARIS试剂盒（美国Ambion公司）提取包含miRNAs在内的总RNA。目前对qRT-PCR探针法尚无统一的参照物规定，所以我们在加入变性液后将人工合成线虫miR-39（Invitrogen公司）以10-4pmol/μl浓度加入每个血清样本中，充当管家miRNA[6]。变性后，对水状的总RNA进行洗脱、定量，再储存至-80℃冰箱中。

1.3 SOLiD测序

随机选出并分别混合3例怀有CHD胎儿的母体血清和3例对照组母体血清，提取总RNA后，将同等质量的总RNA进行连接、逆转录以及PCR扩增，应用SOLiD System Small RNA Analysis Pipeline 工具进行边合成边测序，最终选出11个差异表达的miRNAs进行验证。

1.4 逆转录和定量PCR（qPCR探针法）

剩余27对样本分别使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒和miRNA特异逆转录探针将总RNA逆转录成cDNA。逆转录条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保持。随后将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，条件为：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s和60℃ 1 min 40个循环，所有标本均检测3次。采用相对定量方法（2-△△CT法）对定量结果进行比较分析。

1.5 统计学分析

用SPSS 13.0软件进行统计分析。人口统计及临床特点的分析使用t检验，而对两组间的母体血清miRNAs表达水平的统计则用曼-惠特尼U检验。P＜0.05提示差异有统计学意义，所有统计学检验均为双侧。

2 结果

表1 母体血清miRNAs的相对表达量

2.1 发现生物标记物

在3对样本中，我们通过计算序列中miRNAs的平均表达量和差异倍数，总共选出11个异常表达miRNAs进行验证，其中9个为上调2倍以上miRNAs（miR-19b，miR-26a， miR-375，let-7a， miR-22，miR-21 miR-221, miR-29c and miR-15b），2个为下调0.5倍以上miRNAs（miR-27b and miR-24）。

2.2 验证miRNAs

在剩余的27对样本中，运用qRT-PCR探针法发现，有4个miRNAs（miR-19b, miR-22, miR-29c，miR-375）在病例组中显著高表达，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 母体血清miRNAs对胎儿先天性心脏病的诊断价值

我们随后对这4个miRNAs分别画了ROC曲线，并计算了曲线下面积（AUC）来评估每个miRNA诊断胎儿CHD的灵敏性和特异性。miR-19b，miR-29c，miR-375 和miR-22的具体灵敏性和特异性分别是74.1% 和77.8%，63.0% 和88.9%，70.4%和66.7%, 55.6% 和85.2%，见图1。

3 讨论

前期大量研究已经证实了CHD与新生儿死亡率的密切关系，但直到现在仍没有一项检测胎儿CHD的金标准。在这项研究中，我们分别提取了正常孕妇和怀有CHD胎儿孕妇的血清，旨在通过检测其中miRNAs的不同表达，将其作为胎儿CHD早期筛查的生物标记物。经证实，有4个miRNAs（miR-19b，miR-22，miR-29c and miR-375）在胎儿CHD中显著高表达，且灵敏性和特异性均较高，在临床中具有良好的指导价值。

图1 4个miRNAs的ROC曲线

自从lin-4作为第一个被发现的miRNA以来[7]，已证实血清/血浆miRNAs与多种疾病相关，而对于CHD来说，有专家发现miR-133、miR-1、miR-196a、miR-138、miR-126可以通过造成心肌肥大，发育顺序颠倒、血管内皮生成等方式造成心血管畸形[8-9]。此次发现的4个miRNAs中，miR-19b-1可以抑制血管生成，减慢内皮细胞增殖[10]；miR-22表达上调会激活心肌纤维细胞加快心脏衰老[11]；而miR-375和miR-29c则被认为对食管鳞癌、鼻咽癌等有致癌作用[12-13]。目前尚没有研究报道，这4种miRNAs与先天性心脏病相关。

总之，我们发现并证实了miR-19b、miR-22、miR-29c、 miR-375这4种miRNAs可以作为产前筛查胎儿CHD的关键性非侵入性生物标记物。而如果要将这4个血清miRNAs应用到临床实践中还需要更多的研究和优化。

[1]Eleftheriades M，Tsapakis E，Sotiriadis A，et al. Detection of congenital heart defects throughout pregnancy；impact of first trimester ultrasound screening for cardiac abnormalities[J]. J Matern Fetal Neonatal Med，2012，25（12）：2546-2550.

[2]Trojnarska O，Grajek S，Katarzynski S，et al. Predictors of mortality in adult patients with congenital heart disease[J]. Cardiology Journal，2009，16（4）：341-347.

[3]Brase JC，Johannes M，Schlomm T，et al. Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer[J]. International Journal of Cancer，2011，128（3）：608-616.

[4]Thum T，Catalucci D，Bauersachs J. MicroRNAs：novel regulators in cardiac development and disease[J]. Cardiovascular Research，2008，79（4）：562-570.

[5]Yu Z，Han S，Hu P，et al. Potential role of maternal serum microRNAs as a biomarker for fetalcongenital heart defects[J]. Medical Hypotheses，2011，76（3）：424-426.

[6]Mahn R，Heukamp LC，Rogenhofer S，et al. Circulating microRNAs （miRNA） in serum of patients with prostate cancer[J]. Urology，2011，77（5）：1265-1269.

[7]Wightman B，Ha I，Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans[J]. Cell，1993，75（5）：855-862.

[8]Cordes KR，Srivastava D，Ivey KN. MicroRNAs in cardiac development[J]. Pediatric Cardiology，2010，31（3）：349-356.

[9]Kwon C，Han Z，Olson EN，et al. MicroRNA1 influences cardiac differentiation in Drosophila and regulates Notch signaling[J]. Proc Natl AcadSci USA，2005，102（52）：18986-18991.

[10] Yin R，Bao W，Xing Y，et al. MiR-19b-1 inhibits angiogenesis by blocking cell cycle progression of endothelial cells[J]. BiochemBiophys Res Commun，2012，417（2）：771-776.

[11] Jazbutyte V，Fiedler J，Kneitz S，et al. MicroRNA-22 increases senescence and activates cardiac fibroblasts in the aging heart[J]. Age （Dordr），2013，35（3）：747-762.

[12] Komatsu S，Ichikawa D，Takeshita H，et al. Prognostic impact of circulating miR-21 and miR-375 in plasma of patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Expert OpinBiolTher，2012，12（Suppl 1）：S53-S59.

[13] Zeng X，Xiang J，Wu M，et al. Circulating miR-17，miR-20a，miR-29c，and miR-223 combined as non-invasive biomarkers in nasopharyngeal carcinoma[J]. PLoS One，2012，7（10）：e46367.

撰写医学论文的基本要求

一、科学性 指论文所介绍的方法、论点，是用科学方法来证实，经得起实践的考验。这就要求：

（1）进行科研设计时有周密的考虑，排除可能干扰结果的不利因素；

（2）设立必要的对照组，甚至双盲对照研究；

（3）对实验和观察的数据，要进行统计学处理；

（4）无论是理论研究或实验研究，对结果的分析要从本课题资料出发，得出恰当的结论，切忌离题空谈设想和抽象推理。

二、先进性（创造性） 是指论文是否达到一定的科学水平，一篇论文尽管具备了科学性，但不一定是先进的，因为这个工作可能在数年前甚至十几年前已被别人证实过了。医学论文的先进性，可以从两个方面来衡量：

（1）是理论水平，如原理探讨，疗效机制等是否有新的突破；

（2）是实践水平，如诊断水平或治疗效果是否高于一般水平及技术操作是否特别先进；但不论是实践水平或是理论水平的衡量，均应与同类成果现时的水平相比较，如与国外的、国内的、本地的同类课题水平比较才能给予评价。

三、实用性（应用性） 一是与临床联系的课题，二是可重复性。

Identification of Maternal Serum MicroRNAs as Novel Noninvasive Biomarkers for Prenatal Detection of Fetal Congenital Heart Defects

ZHU Shasha Cardiology Department, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou Jiangsu 215006, China

ObjectiveCongenital heart defects (CHD) are the most common form of malformation during embryonic development. Our current study focused on the altered expression of maternal serum miRNAs and their correlation with fetal CHD.MethodsFrom 18～22 weeks of gestation in maternal serum total RNA, then using SOLiD sequencing and fuorescence quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) method to detect the relative expression of miRNAs in maternal serum, calculate the sensitivity and specificity of the application of statistical methods.ResultsmiR-19b, miR-22, miR-29c and miR-375 expression of the 4 miRNAs in maternal serum with fetal congenital heart disease increased signifcantly, and they are used as markers of the area under the curve (AUC) were 0.790, 0.671, 0.767 and 0.693, can efectively discover fetal congenital heart disease.ConclusionThe results showed that there are 4 kinds of serum miRNAs can be used as a key non-invasive biomarker for prenatal diagnosis of fetal congenital heart disease.

Maternalserum miRNAs, Biomarkers, Congenital heart disease

R714.51

A

1674-9308（2016）36-0059-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.36.032

苏州大学附属第一医院心内科，江苏 苏州 215006