消毒对病毒杀灭效果的实验室评价

吴云鼎综述 解保生审阅

(1.昆明医科大学附属儿童医院口腔科，云南 昆明 650000；2.昆明医科大学附属口腔医院，云南 昆明 650031)

消毒对病毒杀灭效果的实验室评价

吴云鼎1综述 解保生2审阅

(1.昆明医科大学附属儿童医院口腔科，云南 昆明 650000；2.昆明医科大学附属口腔医院，云南 昆明 650031)

病毒感染是人类所面临的一项严峻挑战，尤其是近些年来医院内感染控制形势严峻和新型病毒感染疫情的爆发，使得有效控制病毒的传播感染受到越来越多的关注。对于阻断病毒的传播感染，消毒剂的研究使用是一个重要的手段。消毒剂种类繁多，日新月异，随之而来的问题就是如何有效客观地评价各种消毒剂对病毒的消毒效果。在此，本文拟对实验室评价消毒对病毒消毒效果的方法做一综述。

病毒；消毒剂；效果；实验室评价

病毒是一类个体微小、结构简单、以单核酸作为遗传物质的微生物，只能在活的细胞或组织中存活增殖。在病毒家族中，有的病毒对人类具有很高的威胁性，如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，人类获得性免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus， HIV)以及能够引起严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndromes，SARS)的冠状病毒。新近出现的H7N9禽流感病毒也被证实对人类存在感染致病性[1]。其中对口腔诊疗威胁性较大的是HBV，截止到2013年，全世界约有20亿HBV携带者[2]，加强口腔诊疗中HBV感染的控制显得尤为重要。人类关于由病毒导致的疾病的最早记载可追溯到公元前3世纪，自19世纪末病毒的存在被证实发现以来，人类对于病毒危害的认识也在不断的深化。加上近些年来由病毒感染引起的疫情爆发及防控形势的日趋严峻，有关病毒的消毒问题受到了更多的关注。在病毒的消毒杀灭方面，消毒剂的使用是重要的一环。

消毒剂或其他消毒方法在正式投入实际使用之前，需要先进行消毒效果评价，目前在实验室中常用的评价病毒消毒效果的方法主要有分子生物学评价法和细胞培养评价法。分子生物学的评价方法，如实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)[3]、酶连免疫反应(ELISA)[4]等；细胞培养方法是建立病毒易感细胞模型来将、检测消毒效果[5]。在此基础上又衍生出替代病毒评价法，该法是采用于所研究的病毒遗传和性状类似的病毒，通过评估消毒对该病毒的消毒效果来评估消毒剂的作用效果[6]。本文拟对消毒对病毒杀灭效果的实验室评价的有关问题做一综述。

1 常用消毒剂消毒效果评价方法(Frequently-used experimental assay approaches)

消毒对病毒杀灭效果的分子生物学评价法多为一些分子生物学的实验方法，其特点是对构成病毒的某一稳定成分进行定量测定，如核酸、蛋白抗原或消毒反应形成的复合物等，根据相应指标反映消毒对病毒的灭杀效果。

1.1 实时定量PCR(Real-time PCR assay) 核酸是病毒的重要组成部分，乙型肝炎病毒的遗传物质为长约3 200 bp的DNA，分别编码乙肝病毒的聚合酶、表面抗原和蛋白质等[7]，乙肝DNA遗传物质在病毒的复制感染和性状表现方面具有非常重要的作用。乙型肝炎病毒DNA的水平反映了乙肝病毒的复制数量及感染严重程度，与病情进展密切相关。临床上，HBV DNA的数量水平是乙型肝炎临床疗效评价的一个重要指标[8-9]。在Real-time PCR问世后不久，就有学者将其运用于HBV DNA水平的检测[10]，并随着时间的推移，该技术也成为了临床上诊断乙型肝炎和评估抗HBV治疗效果的常规技术。Real-time PCR作为当前临床上有效检测HBV DNA的手段，在消毒剂对HBV消毒效果的评价中也发挥着积极的作用[3]。该方法的基本原理是使用荧光标记分子，对样本扩增时每个循环荧光信号积累进行检测，通过荧光信号的积累来计算出起始的样本拷贝数。Real-time PCR可以粗分为染料法和探针法两种。染料法成本相对较低，最常用的为SYBR I型染料，但是因为染料与反应体系中的双链DNA(如引物二聚体)都能够产生结合，从而发出荧光，在使用时需要通过溶解曲线来评价反应的特异性。探针法则成本较高，探针的设计基本针对的是目标中的保守序列，特异性强，目前临床上使用的商品化HBV DNA检测试剂盒多属探针法。虽然Real-time PCR技术有着快捷高效、特异性强的优点，但是它在某些条件下并不适用于病毒的检测和消毒效果的评估。在病毒的检测方面，病毒的分离始终是病毒检测的金标准。Suarez等[11]在“实时定量PCR测定多种消毒剂对禽流感病毒消毒效果的研究”中，发现经过酚类消毒剂消毒后，病毒分离结果提示样本中已经无H7N2病毒存在，但是经Real-time PCR仍然可以在样本中检测到H7N2病毒核酸。出现这种状况的原因可能是由于酚类消毒剂的消毒机制主要是通过破坏H7N2病毒的“外壳”，而并不破坏病毒的遗传物质，致使Real-time PCR产生与实际不相符合的结果，如果在此以Real-time PCR的结果作为消毒效果评价的依据，将会导致对消毒剂消毒效果的错误认识，认为消毒剂没有充分杀灭病毒，进而降低了对消毒剂效果的评价的客观性和准确性。这提示在选择评价消毒对病毒的杀灭效果时，应该根据检测的病毒组分和充分考虑消毒反应会产生的结果来选择合适的消毒效果评价方法。除了Real-time PCR定量检测病毒，根据研究需要，也可以使用PCR对病毒进行定性检测。Bisset等[12]在“胃肠道内窥镜消毒失败影响因素的前瞻性组群研究”中，使用PCR技术检测经过标准流程消毒后胃肠道内窥镜表面残留的微生物情况，发现使用过的胃镜消毒后仍存在污染的几率与其使用的次数呈明显的正相关，其中有1例丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)阳性患者使用的胃镜消毒后，经PCR可检测到HCV存在，尽管消毒剂未能完全杀灭胃镜上的HCV，但其残留的量并不足以引发二次HCV感染，通过电话回访使用过内窥镜的500例患者，无一例报告有相关并发症产生。

1.2 酶联免疫反应吸附剂测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) Engvall等[4]于1971年发文报道了关于酶联免疫反应吸附剂测定IgG抗体含量的研究后，ELISA被广泛用于液体标本中微量物质的测定，并得到不断地发展完善，对病毒抗原抗体的测定也是ELISA的应用之一。ELISA技术的原理是通过反应生成酶－抗原/抗体有色复合物，颜色的深浅与有色复合物的量成正比关系，由于酶的活性非常高，所以ELISA技术的灵敏度也很高。1995年，Gasparini等[13]采用ELISA技术检测消毒剂Virkon(商品名“卫可”，美国杜邦公司产品)对器械表面HBV的消毒效果，结果显示Virkon消毒10 min可有效清除HBV的表面抗原HbsAg；在“γ射线灭活HIV-I型病毒感染”研究中，Smith等[14]研究采用不同剂量的γ射线对HIV-I型病毒进行照射后，采用ELISA检测HIV-I型病毒的核心抗原，测试照射对HIV-I型病毒的杀灭效果，结果显示随着照射剂量的上升，逆转录酶的活动减弱，2.5 Mrad剂量的γ射线照射能够有效抑制HIV-I型病毒的增殖；Mikhail等[15]在“丙型肝炎患者使用肠道内窥镜造成交叉感染的前瞻性研究”中，通过ELISA检测HCV携带者使用过的内窥镜消毒后HCV表面抗原的存在，以此判定是否可能造成HCV交叉感染，结果显示149例HCV携带者使用过的肠道内窥镜经消毒后再次使用并不会造成新的HCV感染。ELISA为病毒检测提供了一种行之有效且可靠的检测方法，拓宽了实验室评价消毒剂消毒效果的途径。在前述分子生物学方法中，一般需要直接获取拟研究的相关病毒。但是由于一些作为研究对象的病毒无法直接在体外进行培养增殖，可能不便于直接获取。学者们利用某些病毒之间在遗传和性状方面有着较高的相似性这一特点，运用与拟研究病毒的遗传基因和性状相似的病毒作为替代实验对象，于是“替代病毒评价法”应运而生。该法通过评估消毒剂对“替代病毒”的消毒效果，进而推测该消毒剂对拟研究病毒的消毒效果。这些病毒之间不只是遗传和性状相似，在某些条件下对外部的刺激和反应也很相似，如鸭乙肝病毒(Duck Hepatitis B virus，DHBV)在造成和诱导长期感染方面和人HBV非常类似[6]。

众所周知，HBV几乎不能在体外进行培养增殖，也不会对常见的实验动物造成感染[16]。DHBV与HBV同属脱氧核苷酸病毒科，鸭乙肝病毒在性状组成和致病性方面与HBV高度相似，且其自身对于消毒剂的敏感度与HBV近似，对人无明显致病性[17]，因此被广泛地用于替代HBV进行消毒效果评价。由于DHBV对鸭易感，可以在鸭上建立DHBV感染动物模型，DHBV动物模型的建立促进了对HBV消毒的研究[17-20]。除了HBV有与之相似的病毒可以作为替代病毒进行研究，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)和诺瓦克病毒(Norwalk virus，NV)也分别有可替代的病毒来代替它们进行消毒效果的评价研究。HCV自身属于RNA病毒，由于缺乏适合HCV生存的细胞培养体系，加之该病毒只感染特定宿主，体外增殖培养困难，在HCV的消毒研究当中，采用的替代病毒为牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)。BVDV根据基因型的不同可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种类型，然而两种基因型的BVDV都与HCV在基因结构上具有相似性[21]，且BVDV与HCV在增殖方式上也有相似之处[6]。NV病毒易引起胃肠道感染，NV与猫杯状病毒(Feline calivirus，FCV)两者在基因组成和生化性质上非常类似[22]，且FCV容易在体外培养的细胞中生长存活，方便取材和培养。除了FCV，兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)也与NV非常类似，可作为NV的替代病毒用于研究。所以研究无法在体外进行培养病毒的消毒效果时，往往使用前述的替代病毒进行。一些国家和地区也接受和采取替代病毒测试的结果作为新型消毒剂消毒效果评价的标准，如美国FDA承认消毒剂对DHBV消毒效果作为HBV消毒效果测试的参考标准[23]。

1.3 细胞培养评价法(Cell culture assay) 细胞培养评价法是通过病毒感染体外培养的细胞，继而从感染细胞中获取病毒，置于消毒剂中进行消毒效果测定，是一种传统的评价消毒剂对病毒消毒效果的方法。早在1985年，Keswick等[5]就采用恒河猴肾细胞来评价氯消毒剂对诺瓦克病毒在饮用水中的消毒效果，在接下来的数年当中，应用细胞培养的方法来评估消毒剂对病毒消毒效果的研究也日渐增多[24-25]。但是细胞培养方法耗时长，灵敏度不如PCR，也有不同意见认为细胞培养方法不适合用于病毒的消毒效果研究[25]。

2 病毒消毒效果评价方法的选择

如前所述，目前有多种病毒消毒效果的评价方法可供选择。在实际情况下，应该根据实际需要来选择合适的病毒消毒效果评价方法，以达到客观评价消毒对病毒杀灭效果的目的。要达到这个目的，需要注意以下两点：首先应该明晰消毒剂的作用机理，才能有针对性地选择消毒效果的检测指标，因为不同的检测方法针对的对象不同，如PCR方法检测的对象是病毒的核酸(RNA或者DNA)，而ELISA则是检测病毒蛋白抗原的有效方法。如果对消毒剂的消毒机理和反应情况了解不足，就可能会出现与前述的禽流感病毒消毒效果研究类似的情况—病毒表面抗原已经灭活而Real-time PCR仍然可以检测出病毒核酸的存在，事实上该研究使用的6种消毒剂当中，只有含氯消毒剂和过氧化物消毒剂对禽流感病毒的核酸造成了破坏[11]。其次，要了解采用的技术的优点和缺点，扬长避短，根据实际情况来调整实验策略。同样采用Real-time PCR对HBV的消毒效果进行检测，扩增的HBV序列范围不同(部分基因189 bp和全基因组3 200 bp扩增)，其检测结果也大不相同，全基因组扩增显示RD88消毒剂(1.3%过氧乙酸和7.5%过氧化氢)消毒60 min可以杀灭97%的HBV，而部分基因扩增显示RD88消毒剂60 min只能杀灭75.4%的HBV[26]，分析导致这种差异可能的原因之一是消毒剂虽然破坏了HBV的基因结构，但是被破坏的基因结构中可能恰好包含了所选取的189 bp的序列在内，与未被破坏的基因同时得到了扩增，故而有此差异存在。建议在选用Real-time PCR评估消毒剂对HBV的消毒效果时，采用全基因组扩增更为可靠。

因此在评价消毒剂消毒效果的实验中，采用的检测方法应该根据实际的需要，结合现有条件来综合考虑，选取适宜的检测方法，以达到客观准确评价消毒剂消毒效果的目的。

3 总 结

消毒一直是感染控制中的重要环节，是阻断病原体传播致病的有效手段，也是许多学者致力研究的课题之一。高效安全的消毒剂可以帮助减少感染的传播和降低院内感染的概率，提高医疗环境的安全性。现目前各种消毒剂种类繁多，效用不一，因此合理地选择合适的实验方法，客观地评价消毒剂的消毒效果，有助于消毒剂的使用和改进，同时指导人们正确选择合适的消毒方式，以达到较好的病毒杀灭效果，从而控制病毒的感染和传播，减少病毒的致病可能，创造更加安全的医疗卫生和生活环境。

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Experimental evaluation on the germicidal efficacy of disinfectant.

WU Yun-ding1,XIE Bao-sheng2.1.Department of Stomtology,the Affliated Children's Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650000,Yunnan,CHINA;2.The Affliated Hospital of Stomatology of Kunming Medical University,KunMing 650031,Yunnan,CHINA

Virus infection is a severe challenge for human.In recent years,increasing nosocomial infection and ourbreak of new virus have forced us to pay more and more attention to the effective control of virus infection and transmission.The research and use of disinfectant occupies an important position in cutting off virus infection and transmission.And the trouble with disinfectant growth is how to grant an objective and effective evaluation to disinfectant efficacy.Here,an overview on the methods of experimental evaluation on disinfectant efficacy will be presented.

Virus;Disinfectant;Efficacy;Experimental evaluation

R613

A

1003—6350（2016）04—0613—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.04.033

2015-07-10)

云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项项目(编号：U0120140798)

解保生。E-mail：wrd5501@163.com