病理性胎儿生长受限的产前诊断研究进展

马莹 综述 吴青青 审校

(首都医科大学附属北京妇产医院产科，北京 100026)

病理性胎儿生长受限的产前诊断研究进展

马莹 综述 吴青青 审校

(首都医科大学附属北京妇产医院产科，北京 100026)

胎儿生长受限为产科高危妊娠，病因复杂，表现为胎儿生长发育缓慢，可伴有或不伴有胎儿畸形及胎儿窘迫，其实质是胎儿未达到其应发育的全部潜能，发生胎儿生长受限的一部分病因与遗传物质异常相关，由于遗传物质异常导致的胎儿生长受限，往往发生孕周时间较早，生后还会面临体格和智能方面的发育异常或迟缓，并且尚无有效的治疗方法，所以评估胎儿是否为病理性生长受限是产前诊断的重点。通过利用细胞遗传学和分子遗传学技术，从染色体核型分析、FISH、各种PCR相关技术到染色体微阵列分析技术，分析胎儿染色体和基因，来预防严重病理性生长受限患儿的出生。近年来产前诊断技术不断成熟，研究逐渐深入。本文就各种遗传学技术方法在此方面的进展作为综述。

胎儿生长受限；产前诊断；核型分析；微阵列分析；单核苷酸多态性

胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)即因各类原因所致胎儿体质量低于同孕龄平均体质量第10百分位数或低于同孕龄平均体质量的2个标准差，或孕37周后出生体质量小于2 500 g。国内外报道FGR的发生率占所有妊娠的3%～10%，FGR胎儿的死亡率较高，可出现新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)、低体温、脑室出血及血糖水平低下等并发症，还可能面临出生后的生长发育和智力问题，出现较多的远期并发症，临床研究还发现FGR与部分成人疾病相关[1-2]。胎儿体重的差异受遗传因素、母源性疾病和胎盘、脐带等因素影响，自胚胎期起遗传因素即开始发生作用，并在生后的整个生长发育期继续发挥重要作用。FGR实质是胎儿的生长没有达到所遗传的全部潜能，体现在胎儿出生体质量低，或伴有胎儿畸形，一部分FGR胎儿与遗传异常相关，遗传异常可包括有染色体的数目和结构的改变，基因突变，染色体细微结构的异常即拷贝数变异(copy number variations，CNVs)，目前国内外欠缺有效治疗染色体疾病的方法，因此辨别遗传异常相关的病理性FGR，是FGR产前诊断的重点，利用何技术怎样寻找其发病原因，筛查病理性FGR，多年来临床研究者做了相当多的工作，取得了较大的成就，现综述如下：

1 染色体核型分析及FISH

染色体结构和数目异常可引起FGR和儿童生长发育滞后。染色体核型分析技术是利用染料处理标本后染色体显带的特点，肉眼在显微镜下观察染色体形态和数目结构，分辨率低，可检测到大片段约5 Mb以上的遗传物质改变。1992年报道研究了60名身材矮小女性(n= 60)的染色体核型分析，结果为45，X(n=22)，46，XX/46, Xi(Xq)(n=4)，46,XX/46,XXq-(n=3)……46,XX(n=11)，而且相关性研究显示患者临床表型的严重程度与X染色体数目相关，证实了部分女性的身体发育与X染色体异常相关[3]。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是分子遗传学和免疫学相结合，使用荧光素标记探针，与分裂中期的染色体或分裂间期的染色质进行杂交，在荧光显微镜下检查并定位、定性得出结果。相较染色体核型分析，FISH具有独特的优势，耗时短，检测灵敏度高，而且可用于外周血细胞、脐血、未经培养的间期细胞染色检查，在制备特定的探针后甚至可以筛查染色体微缺失综合征，可进行产前诊断及胚胎植入前诊断[4]，但FISH技术不能检测全染色体范围的异常，局限性较大。

2011年姚妍怡等[5]报道对于74例FGR，染色体核型分析出染色体异常为9.4%(8/74)，8例异常染色体核型包括数目异常6例及结构异常2例，平衡易位1例，倒位1例，研究结果发现均称型FGR组染色体异常核型检出率高于非均称型FGR组，合并胎儿畸形的均称型FGR染色体异常率高达36.3%(4/11)，未合并胎儿畸形的均称型FGR染色体异常率仅为5.0% (1/20)，说明染色体异常是均称型FGR的病因之一，合并胎儿畸形的均称型FGR染色体异常率高于不合并胎儿畸形的均称型FGR。钟进等[6]采用染色体核型分析技术对20例FGR进行核型分析，结果发现胎儿染色体异常1例，该例患者孕38周时超声提示胎儿双顶径相当于孕31周，股骨长相当于孕35周，脐血染色体核型显示45,XN,rob(14:15)(q10:q10)，诊断胎儿为病理性FGR。2014年国外报道回顾调查2008-2012年孕14～27周超声提示腹围小于第五百分位的单胎FGR 239例，37例(15%)胎儿有异常的染色体核型或明确的异常综合征，67例(28%)胎儿有至少一个相关的结构异常而没有染色体非整倍体异常和综合征[7]，说明染色体异常是发生FGR的病因之一，超声测量发现胎儿小于相应孕周后应详细筛查是否同时存在胎儿解剖结构异常，产科医生需要对FGR胎儿加以重视和考虑进行产前诊断。但是染色体核型分析技术有诸多限制，如细胞培养的耗时长、有失败率以及分辨率较低等。

2 微阵列-比较基因组杂交

染色体微缺失综合征指亚显微结构的小片段染色体缺失所造成的临床症候群，缺失区域有时可以包含一个或多个基因，一种新的产前诊断和先天性疾病诊断技术，称为微阵列-比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization，aCGH)，此技术为采用不同荧光标记的待测DNA和参照DNA杂交，杂交后的基因芯片被扫描，通过比较两种荧光强度的比率，在全基因组范围内检测是否存在片段缺失或扩增，称为拷贝数变异(CNVs)。CNVs是指通过与参考基因组序列相比较存在的染色体结构差异，包含微缺失或微重复，发生在基因组区域的CNVs可引起表型异常或遗传疾病或增加疾病易感性[8]。但是研究已经发现在人类即使是不同的人群中基因组中出现CNVs是很常见的。分析CNVs包括三种情况，一为致病性，二为多态性即良性，三为未知性即临床意义尚不明确。通过检查CNVs染色体区域所包含的基因、查找权威CNVs数据库和分析胎儿父母的染色体可以帮助分析其意义。当胎儿的CNVs与表型正常胎儿父母的染色体CNVs相一致，或通过检索数据库发现同样的CNVs存在于正常人群时，这些CNVs很可能是良性，其与胎儿的生长发育异常及胎儿畸形无关。对于存在未知性或新突变的CNVs，需要对此类胎儿进行全面的超声结构筛查以及出生后追踪生长发育情况，这些步骤是临床诊断或产前诊断基因组病的重要环节。由于aCGH具有明显优势，2013年美国妇产科医师协会发布了关于染色体微阵列分析技术在产前诊断中应用的581号指南，提示当超声发现胎儿有一个或多个解剖结构异常时，临床医生考虑可对胎儿母亲行介入性产前诊断，建议使用染色体微阵列分析技术，可取代传统的染色体核型分析，而对超声提示胎儿结构正常的孕妇进行介入性产前诊断时，可使用染色体核型分析或染色体微阵列分析[9]。2011年国内已经有报道利用aCGH技术分析15 767例合并各种发育迟缓、智力障碍和畸形等的异常儿童，其中73%的患儿为智力低下和/或发育迟缓及自闭症，与8 329名健康成人对照比较，发现严重症状的患儿出现大片段的CNVs的发病率增加，明显多于对照组，而且CNVs片段越大病症越严重[10]。

3 聚合酶链式反应(PCR)相关技术

荧光定量聚合酶链反应(quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR)技术利用荧光引物对染色体上特异的短串联重复序列(short tandem report，STR)位点进行扩增，通过检测荧光来判断染色体数目，具有操作简单、耗时短、高效和成本低廉的优点。纪妍等[11]使用染色体核型分析及QF-PCR两种方法对羊水或脐血进行染色体分析，纳入研究1 035例，结果两种方法均能检测出18例染色体非整倍体数目异常，符合率为100%，其认为可将QF-PCR作为产前诊断染色体核型分析的补充检查方法。多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)于2002年首先被报道，是近年来发展的对待检DNA序列可以进行定性和半定量分析的技术，包括杂交、连接和PCR扩增。该技术结合了DNA探针杂交和PCR技术，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，但是不能用于单个细胞的检测，不适合检测未知的点突变类型和不能检测染色体平衡易位。2014年来自哥伦比亚地区的研究显示利用MLPA技术研究了患先天性矮小症患者的DNA，发现8.1%的患者存在有X染色体或Y染色体短臂上控制生长的基因即身材矮小同源盒基因(short stature homeobox，SHOX)的异常，包括基因内和非编码区的插入或缺失变异，而且报道一例患者携带有此基因非编码区的微重复和内含子6 bp的缺失[12]。

4 单核苷酸多态性芯片

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指由于单个核苷酸改变而导致基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，作为不同个体在某一特定位置上的核苷酸差异，它占全部己知多态性的90%以上并且可以遗传。SNP既有可能在基因以外的非编码序列上，也可能在基因序列内，是以有些SNP会影响基因的功能，一部分遗传性疾病和肿瘤都与基因序列中的核苷酸突变密切相关。与aCGH类似，以单核苷酸多态性芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)为平台的染色体微阵列技术(chromosome microarray analysis，CMA)可对染色体亚显微结构异常进行诊断定位，并能准确地测定其大小。SNP-array的原理是将大量SNP位点序列采用特殊方法固定在硅芯片上，获得高密度的SNP微阵列，然后与样品杂交，通过激光扫描及软件分析获得结果[13]。有报道使用Affymetrix SNP 6芯片发现了8例(19.5%)原始侏儒症或类似表现的儿童存在范围为672～9.158 Mb的CNVs，5例检测到的CNVs的致病性仍不清楚，但是作者建议SNP芯片技术可作为此类患者的遗传学诊断方法[14]。

白小艺等[15]2015年对比312例血清学唐氏筛查高风险孕妇羊水的染色体核型分析与SNP-array两种产前诊断技术结果，两种方法均识别出2例21三体，开展对CNVs的分析有利于进一步研究人类基因组及SNP的多态性情况。付春云等[16]利用SNP-array检测56例生长障碍患儿的外周血，发现性染色体上存在致病性CNVs者6例，常染色体上存在致病性CNVs者6例，异常片段＜2.5 MB的即染色体核型分析无法检出的致病性微缺失或微重复者4例，认为SNP-array技术优于传统的染色体核型分析，可作为遗传学诊断的有效方法。常亮等[17]对照分析SNP array与染色体核型分析技术，发现两者联合分析检出率(12.1%)高于单纯SNP array检出率(11.3%)，远高于单纯染色体核型分析检出率(6.4%)。2014年通过比较多代同堂的高海拔居民(安第斯人)与欧洲移民发生的FGR，检测了与婴儿出生体重相关的63个单核苷酸多态性，利用SNP技术确定了与出生体重相关的参与氧传感和血管控制的两基因PRKAA1和EDNRA[18]。

由于SNP-array的优势，国外已经利用SNP-array技术研究基因识别等领域，但是SNP-array技术也有自身的局限性，就是不能检测是否存在染色体平衡易位，而染色体核型分析可以检出染色体平衡易位。2012年有报道对一例妊娠合并FGR、胎足畸形、脑室扩张及羊水过多的病例进行了产前诊断，发现此病例为一个独特的、涉及2、5和7号染色体复杂的从头重排和2号染色体长臂的多个微缺失，产前诊断为首例2q32微缺失综合征，作者为了全面分析该病例的染色体使用了多个诊断技术，包括染色体核型分析、FISH、aCGH和SNP-array[19]。因此分析复杂的染色体异常时医学研究者需要依靠多个遗传学技术才能明确其核型及病理类型。

综上所述，需要进行产前诊断明确是否为病理性FGR时，目前国内的主要手段是采集羊水或脐带血进行染色体核型分析和/或FISH检查，只能检测出一些大片段的遗传物质异常，会漏诊细微结构异常和致病性CNVs的胎儿。快速、准确如aCGH和SNP-array技术在我国的产科研究中还处于起步和探索阶段，临床研究人员应重视利用先进技术提高产前诊断的水平，避免病理性FGR患儿的出生，提高现有的遗传病检出率。

[1]Kady S,Gardosi J.Perinatal mortality and fetal growth restriction[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynecol,2004,18(3):397-410.

[2]Jacobsson B,Ahlin K,Francis A,et al.Cerebral palsy and restricted growth status at birth:population based case-control study[J]. BJOG,2008,115(10):1250-1255.

[3]Temtamy SA,Ghali I,Salam MA,et al.Karyotype/phenotype correlation in females with short stature[J].Clin Genet,1992,41(3): 147-151.

[4]黄艳仪,孙筱放,黎青,等.应用荧光原位杂交技术诊断羊水细胞染色体异常[J].中华妇产科杂志,1999,34(3):153-156.

[5]姚妍怡,宋婕萍,郭淮,等.74例胎儿生长受限脐血染色体核型分析[J].中国妇幼保健,2011,26(6):884-885.

[6]钟进,郭晓玲,史淑琼.732例孕中晚期胎儿脐血染色体核型分析[J].中国优生与遗传杂志,2013,21(7):38-39.

[7]Vanlieferinghen S,Bernard JP,Salomon LJ,et al.Second trimester growth restriction and underlying fetal anomalies[J].Gynecol Obstet Fertil,2014,42(9):567-571.

[8]Lee C,Scherer SW.The clinical context of copy number variation in the human genome[J].Expert Rev Mol Med,2010,12:e8.

[9]ACOG.Committee Opinion No.581:The use of chromosomal microarray analysis in prenatal diagnosis[J].Obstet Gynecol,2013,122 (6):1374-1377.

[10]Cooper GM,Coe BP,Girirajan S,et al.A copy number variation morbidity map of developmental delay[J].Nat Genet,2011,43(9): 838-846.

[11]纪妍,朱津,卢燕.QF-PCR快速产前诊断常见非整倍体病的价值[J].海南医学,2016,27(1):56-59.

[12]Sandoval GT,Jaimes GC,Barrios MC,et al.SHOX gene and conserved noncoding element deletions/duplications in Colombian patients with idiopathic short stature[J].Mol Genet Genomic Med, 2014,2(2):95-102.

[13]Peiffer DA,Le JM,Steemers FJ,et al.High-resolution genomic profiling of chromosomal aberrations using infinium whole-genome genotyping[J].Genome Res,2006,16(9):1136-1148.

[14]Spengler S,Begemann M,Ortiz Brüchle N,et al.Molecular karyotyping as a relevant diagnostic tool in children growth retardation with Silver-Russell features[J].J Pediatr,2012,161(5):933-942.

[15]白小艺,章钧,田琪,等.单核苷酸多态性芯片与染色体核型分析在唐氏筛查高风险孕妇产前诊断中的比较研究[J].中国病理生理杂志,2015,31(4):707-712.

[16]付春云，陈少科,陈荣誉,等.56例生长障碍患儿单核苷酸多态性基因芯片检测结果分析[J].临床儿科杂志,2014,32(12):1119-1121.

[17]常亮,赵楠,魏媛,等.单核苷酸多态性微阵列与染色体核型分析的产前诊断意义比较[J].北京大学学报(医学版),2014,46(5):676-680.

[18]Bigham AW,Julian CG,Wilson MJ,et al.Maternal PRKAA1 and EDNRA genotypes are associated with birth weight,and PRKAA1 with uterine artery diameter and metabolic homeostasis at high altitude[J].Physiol Genomics,2014,46(18):687-697.

[19]Thorson HL,Surti U,Sathanoori M,et al.Prenatal diagnosis of 2q32 deletion syndrome characterized by multiple segmental deletions and complex chromosomal rearrangement involving chromosomes 2,5 and 7[J].Fetal-Diagn Ther,2012,31(3):196-200.

R714.51

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1003—6350(2016）22—3729—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.22.039

2016-01-16)

吴青青。E-mail：wuqq2013@163.com