原因不明复发性流产患者母胎界面TNF—α的表达

杨美霞　宋芳　赵紫薇

[摘要] 目的 研究TNF-α在原因不明复发性流产患者蜕膜及绒毛组织中的表达水平及意义。 方法 应用免疫组织化学和图像分析，分别对30例原因不明复发性流产患者（病例组）和30例正常妊娠者（对照组） 蜕膜和绒毛组织中TNF-α的表达进行定位和半定量分析。 结果 免疫组织化学结果显示在蜕膜组织中，TNF-α蛋白表达于蜕膜细胞质内，绒毛组织中，TNF-α蛋白表达于细胞滋养层和合体滋养层细胞质内。蛋白含量测定结果显示，病例组TNF-α蛋白表达高于对照组。 结论 病例组蜕膜和绒毛组织中TNF-α蛋白表达的升高与原因不明复发性流产有关，TNF-α可能参与原因不明复发性流产的病理过程。

[关键词] 原因不明复发性流产；TNF-α；蜕膜；绒毛

[中图分类号] R714.21 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2015）24-78-03

[Abstract] Objective To study the expression of TNF-α in decidua and villi of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion （URSA）. Methods With immunohistochemical method and image analysis technology， the local and quantitative expression of TNF-α were detected and analyzed between the patients of URSA （case group） and the patients of normal induced abortion（control group）. Results Immunohistochemistry staining showed TNF-α protein located in cytoplasm of decidua cells in decidua， Immunohistochemistry staining showed TNF-α protein located in cytotrophoblast and synctiotrophoblast cells in villi. The expression of TNF-α protein in case group was distinctively higher than control group. Conclusion The increased expression of TNF-α in decidua and villi is related to URSA， TNF-α may take part in the pathologic process of URSA.

[Key words] Unexplained recurrent spontaneous abortion； TNF-α； Decidua； Villi

原因不明复发性流产指排除所有已知引起流产原因、连续3次或3次以上的反复流产。临床上复发性流产的病因较复杂，除了内生殖器官解剖异常、染色体异常、感染性疾病及环境因素外，仍有超过50%的患者病因不明 [1]。大量研究表明辅助T细胞Th1/Th2的平衡与妊娠结局有密切的关系[2-4]。TNF-α是一类主要由Th1细胞分泌的细胞因子，目前有关复发性流产患者外周血中TNF-α变化的研究较多，但是关于原因不明复发性流产患者母胎界面TNF-α蛋白表达的报道较少，因此本研究应用免疫组织化学方法对原因不明复发性流产患者母胎界面TNF-α的蛋白表达进行定位和半定量分析，以探讨原因不明复发性流产发生的免疫机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取30例2011年3月～2012年4月在包头医学院第二附属医院妇产科门诊就诊的不明原因复发性流产患者作为病例组，入选标准：年龄25～41岁，平均（32.0±1.2）岁。孕周6～12周。自然流产次数均≥2次。经检查排除内分泌、染色体、自身免疫、以及生殖道感染和生殖系统解剖结构等方面疾病后纳入本次研究。选取30例同期就诊于包头医学院附属医院妇产科门诊，要求人工流产终止妊娠的正常早孕妇女作为研究对照组，入选标准：年龄在24～39岁，平均（30.4±0.2）岁。孕周6～10周。既往月经周期规律，无自然流产、死胎、死产史，本次妊娠孕囊符合停经时间，无阴道流血，胚胎发育正常。对照组和病例组于行人工流产时或自然流产发生24h内收集蜕膜及绒毛组织，生理盐水冲洗组织后用4%多聚甲醛溶液固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块，将蜡块切为4～8μm厚的组织切片。

1.2 主要试剂

TNF-α多克隆抗体（兔抗人）、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自北京中杉金桥，即用型SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫组织化学显色

蜕膜和绒毛组织切片先行脱蜡和水化；滴加0.3% H2O2室温孵育10min；将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液，微波修复3min，使抗原的位点暴露出来；滴加正常山羊血清封闭液室温20min；滴加一抗（1∶50的兔抗人TNF-α抗体工作液） 4℃过夜，用PBS代替一抗做阴性对照；加二抗后37℃孵育40min；加SABC后37℃孵育40min；于室温DAB-H2O2显色，显微镜下观察，以控制反应时间；苏木素轻度复染细胞核；脱水，透明，封片后镜下观察。

1.4 图像分析

选取对照组（30例）和病例组（30例）中每例蜕膜组织切片2张、绒毛组织切片2张，在蜕膜组织的蜕膜细胞、绒毛组织的合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞分别随机选取2个单位面积，应用捷达801图像分析系统进行分析测量平均光密度。endprint

1.5 统计学处理

本研究以对照组和病例组平均光密度作为计量资料，采用SPSS17.0软件的测量数据进行统计学处理，组间进行t检验，计算平均值与标准差，计量数据用（）的形式表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF蛋白在绒毛和蜕膜中的组织学定位

在子宫蜕膜组织中， TNF-α蛋白主要定位于蜕膜细胞的细胞质内，呈棕黄色颗粒，两组阳性反应强弱不等（图1A、B），两组的腺上皮细胞内均未见表达。在绒毛组织中，病例组和对照组均可在合体滋养层细胞和细胞滋养层细胞质内见到棕黄色阳性反应颗粒（图1C、D）。

2.2 TNF蛋白在绒毛和蜕膜中的半定量结果

病例组的蜕膜组织和绒毛组织中TNF-α蛋白含量均高于对照组，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

3 讨论

随着免疫学和分子生物学的快速发展，复发性流产病因的免疫学说日益受到重视。Th1/Th2型细胞因子的平衡与妊娠结局有很大关系。正常情况下，妊娠表现为一种特殊的Th2现象，Th1处于一种抑制状态，当发生向Th1型细胞因子过度表达时，将导致流产发生[5-6]。

TNF-α是一类主要由Th1细胞分泌的细胞因子，适量的TNF-α在妊娠早期可调节细胞滋养层和合体滋养层细胞的正常增殖、分化、凋亡，助于蜕膜细胞外基质降解及胎盘植入，利于能量代谢和胚胎发育，促进孕激素和绒毛促性腺激素的生成，对正常妊娠的维持和分娩的发动发挥重要作用[7-9]。黄江宁、钭晓珍等[10-11]检测到复发性流产患者外周血中TNF-α水平较健康早孕妇女明显升高，国内关于TNF-α蛋白在不明原因复发性流产患者蜕膜和绒毛组织中的定位及半定量表达情况的研究报道还较少，因此本研究采用免疫组织化学方法从蛋白质水平检测不明原因复发性流产患者蜕膜和绒毛组织中TNF-α的表达情况。

高艳霞等[12]研究显示TNF-α主要表达于绒毛滋养层细胞内，在蜕膜细胞内无表达，而本研究检测到绒毛滋养层细胞和蜕膜细胞内均有TNF-α表达。结果显示在不明原因复发性流产患者的蜕膜和绒毛组织中TNF-α蛋白表达相对含量明显高于正常早孕妇女，这与Smith等[13]的研究结果一致，提示复发性流产患者母胎界面TNF-α的高表达与流产相关。高浓度的TNF-α 可能与细胞滋养层和合体滋养层细胞中的TNF-α受体结合从而限制细胞滋养层和合体滋养层的生长发育，导致早期胚胎的营养供给和吸收，不利于胚胎着床和妊娠维持。孙燕[14]等研究表明TNF-α能通过激活肥大细胞而损坏母体子宫蜕膜内环境的稳态，致使胚胎停育。Clark等[15]研究表明在母胎界面TNF-α表达增加时对促凝血酶原激酶Fg12的表达有上调作用，使胎盘滋养血管纤维素沉积、血栓形成乃至胎盘梗死 [16]，说就证明高表达的TNF-α是通过多种途径导致流产发生的。

综上所述，TNF-α蛋白在母胎界面的高表达与原因不明复发性流产的发生有密切关系，为该病发病免疫学说提供了证据。由于引发复发性流产的免疫机制极其复杂，因此TNF-α在复发性自然流产中的作用机制还需进一步多方面深入研究。

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（收稿日期：2015-10-15）endprint