中华猕猴桃茎段组培快繁系列技术研究

黄宝菊，王 忠，林梅燕

[安发(福建)生物科技有限公司 352199]

中华猕猴桃茎段组培快繁系列技术研究

黄宝菊，王 忠，林梅燕

[安发(福建)生物科技有限公司 352199]

以中华弥猴桃带腋芽茎段为外植体，研究不同处理方法对外植体灭菌效果的影响，不同激素组合培养基对外植体初代培养和组培苗生根的影响。试验结果表明，最佳灭菌处理：先用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞进行表面灭菌8 min，外植体成活率88%；最佳初代培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，出芽率92%；最佳生根培养基：1/2 MS+IBA 0.15 mg/L+NAA 0.3 mg/L，生根率85.6%。

中华弥猴桃；茎段；组织培养；灭菌条件；激素配方；出芽；生根

中华猕猴桃(简称：猕猴桃)属于猕猴桃科猕猴桃属多年生藤本植物，是20世纪人工驯化栽培的野生果树中最有成就的四大果种之一。其果实具有丰富的营养价值和良好的药用价值，尤其是含有大量的维生素C，素有“Vc之王”的美称。猕猴桃雌雄异株，倍性复杂，育种周期长。传统的育苗方法主要有扦插和嫁接，但成活率和繁殖效率低。同时在生产栽培中，猕猴桃经常发生溃疡病等严重病害，导致枝条萎蔫、枯死等[1]。目前，大量的猕猴桃种苗生产主要来源于组织培养[2]。

要加快其种苗繁殖速度和促进健康栽培，迫切需要建立科学合理的组培快繁生产体系。近年来，有关猕猴桃组培技术的报道颇多，前人对猕猴桃组培的研究方向各有不同。本文以安发(福建)生物科技有限公司自主选育的猕猴桃新品种——回回1号带腋芽茎段为材料，从外植体的灭菌，初代培养诱导出芽，生根培养诱导生根三方面进行试验研究，以期为建立和完善其快繁体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为回回1号两年生雌雄株，于2014年8月下旬至9月下旬的晴天，取长10～15 cm的健壮新梢上的带腋芽茎段为试验材料。

1.2 试验方法与处理设计

1.2.1 不同消毒方法对外植体灭菌效果的试验 将带腋芽的茎段，置于自来水下冲洗30 min，再移至超净工作台中，将无菌水倒于烧杯中搅拌清洗6～8遍。先用75%酒精灭菌，再用0.1%升汞进行表面灭菌，然后无菌水冲洗6～8遍，最后用无菌滤纸吸干茎段表面水分。灭菌后，将茎段以腋芽为单位进行裁剪，剪成1.0～2.0 cm带1个腋芽的茎段，腋芽朝上竖直插入初代培养基中，每个培养瓶中接5个茎段，5次重复。初代培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2 mg/L。培养室温度为(25±1)℃，空气相对湿度60%，每天光照时间14 h，光照强度2400 lx。初代培养7 d统计污染率、21 d统计成活率。

设75%酒精(灭菌时间分为20 s、30 s、40 s)和0.1%升汞(灭菌时间分为6 min、8 min、10 min)9个灭菌组合的处理(表1)，5次重复。

污染率=污染外植体数/接种外植体数×100%

成活率=成活外植体数/接种外植体数×100%

1.2.2 不同培养基对初代培养的试验 将已灭菌的1.0～2.0 cm带1个腋芽的茎段，腋芽朝上竖直插入诱导培养基中，每个培养瓶中接5个茎段。培养室温度为(25±1)℃，空气相对湿度80%，每天光照时间14 h，光照强度2400 lx。诱导培养40 d时统计生长状况(出芽率)。

设不同激素水平组合的9个初代培养基处理：MS+6-BA(1.0、1.5、2.0) mg/L+NAA(0.1、0.2、0.3)mg/L(表2)，5次重复。

出芽率=出芽外植体数/接种外植体数×100%

1.2.3 不同培养基对组培苗生根的试验 将经过诱导培养的茎段转接入生根培养基，腋芽朝上竖直插入生根培养基中，每个培养瓶中接5个茎段。培养室温度为(25±1)℃，空气相对湿度80%，每天光照时间14 h，光照强度2500 lx。生根培养30 d时统计根生长状况。

设不同激素水平组合的9个生根培养基处理：1/2MS+ IBA (0.10、0.15、0.20)mg/L + NAA(0.2、0.3、0.4)mg/L(表3)，5次重复。

生根率=生根外植体数/接种外植体数×100%

生根数=外植体生根总根数/接种外植体数

根长=外植体根的总长度/外植体生根总根数

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对外植体灭菌效果的影响

由表1看出，酒精或升汞对外植体灭菌的影响是相似的，当灭菌时间不足时(处理1：75%酒精20 s+0.1%升汞6 min)，污染率高达80%；适当延长灭菌时间，污染率显著降低，当75%酒精灭菌40 s+0.1%升汞灭菌8 min时，污染率降至8%。表1结果还表明，虽然延长灭菌时间能够达到好的灭菌效果，但外植体的成活率却随着灭菌时间的延长呈现先升后降的趋势，这与过度灭菌对外植体细胞产生的毒害作用有关。从污染率和成活率两方面考虑，以处理5的效果最理想，其污染率20%、成活率88%，即以先用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞进行表面灭菌8 min为最佳灭菌处理。

表1 不同灭菌处理对猕猴桃茎段成活率的影响

2.2 不同培养基对不定芽诱导培养的影响

由表2看出，适宜的植物生长激素组合对外植体不定芽的诱导具有促进作用，结合出芽率数据分析，当植物激素浓度较低时(处理1：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L)，出芽率最低；植物激素浓度适当升高，出芽率显著提高，以处理5的出芽率最高；但是，当植物激素浓度继续升高时，出芽率反而降低，这与高浓度的植物激素抑制了不定芽的诱导有关。综上所述，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L为最佳初代培养基。

表2 不同诱导培养基对猕猴桃茎段出芽率的影响

注：基础培养基为MS。

2.3 不同培养基对组培苗生根的影响

由表3看出，适宜的植物生长激素组合对外植体不定芽生根的诱导具有促进作用，当激素浓度较低时(处理1、处理2)，生根速度慢，根系虚弱；激素浓度适当升高(处理5)，生根速度加快，根系较强壮；当激素浓度继续升高时，根系生长趋于弱化，这与高浓度的植物激素抑制了对不定芽生根的诱导作用有关。综上所述，1/2MS+IBA 0.15 mg/L+NAA 0.30 mg/L为最佳生根培养基。

表3 不同生根培养基对猕猴桃组培苗生根的影响

注：基础培养基为1/2MS。

3 结论与讨论

相对于不同灭菌试剂或灭菌试剂组合的效果，灭菌试剂处理时间对外植体的成活率影响很大，直接表现为灭菌试剂处理时间短，灭菌效果差； 而灭菌试剂处理时间过长则可能对外植体的细胞和组织造成损害[3-4]。本试验结果表明，对猕猴桃外植体的最适宜灭菌条件为：先用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞进行表面灭菌8 min。

适宜的植物激素组合对外植体不定芽的诱导有促进作用，植物生长素(NAA等)和植物细胞分裂素(6-BA等)配合使用，比例协调时可促进芽苗主茎生长[5-9]。本试验在诱导不定芽阶段，采用NAA和6-BA配合使用，当6-BA浓度为1.5 mg/L、NAA浓度为0.2 mg/L时，出芽率高达92%。

在组培过程中，不定芽的根部生长情况直接影响组培苗的产量，而诱导培养基和植物类激素又在其中起到关键性的促进作用。王大平等[10]认为1/2 MS培养基上最适合用于猕猴桃组织培养的外植体诱导生根，生根率、平均生根数分别是MS培养基的5.05倍、6.46倍。此外，对于不同的植物生长激素的研究表明，其作用及影响各不相同，如：IBA对外植体根的诱导效果较好[11]，NAA和6-BA按照一定比例混合使用可起到促进芽苗主茎生长的作用。在诱导根的生长阶段，本试验采用NAA和IBA结合使用，当IBA浓度为0.15 mg/L和NAA浓度为0.30 mg/L时，生根率最高，根数最多，促进生根的效果明显。

通常对规模化植物组织培养可分为五个阶段：外植体灭菌、初代培养、增殖培养、生根培养及出瓶炼苗。本试验是针对外植体灭菌，初代培养和生根培养3个阶段开展的研究，其结果可为安发(福建)生物科技有限公司自有品种‘回回1号’猕猴桃工厂化育苗提供一定的技术支持。同时，猕猴桃组培苗增殖培养、出瓶炼苗等相关工作还有待于进一步深入研究。

[1]汪克强，周建峰，王晓兵.红阳猕猴桃的栽培管理技术[J].西北园艺,2010(6):13-15.

[2]谢志兵,鲁旭东.猕猴桃组织培养中适宜激素组合的筛选[J].北方果树,2003(3):7-8.

[3]周维燕.植物细胞工程原理与技术[M].北京:中国农业大学出版社，2001:16.

[4]岑湘涛,沈伟,杨美纯,等.木薯组织培养外植体选择和灭菌研究[J].江苏农业科学，2014(11):71-72.

[5]姜维梅,李凤玉.大籽猕猴桃离体再生系统的建立[J].浙江大学学报，2003，29(3):295-299.

[6]徐萌.扶芳藤组织培养再生体系建立研究[D].北京: 北京林业大学，2005.

[7]张敏.巴戟天优良材料筛选与组培快繁技术[D].福州：福建农林大学，2010.

[8]杨永花,张美玲,张新瑞，等.藤本月季组织培养初报[J].甘肃农业大学学报.2008,43(5):63-66.

[9]张玉杰.狗枣猕猴桃离体快繁的研究[D].长春：吉林农业大学，2014.

[10]王大平,杨玲.猕猴桃组培苗生根培养的研究[J].安徽农业科学，2008，36(21):8930-8931.

[11]袭文达.园艺植物组织培养[M].第2版.上海:上海科学技术出版社，1986：43-45.

(责任编辑：杨小萍)

Tissue culture and rapid propagation technique forActinidiachinensis

HUANG Bao-ju, WANG Zhong, LIN Mei-yan

[Anfa(Fujian)Bio-technologyCo.,Ltd.,FujianProvince352199]

Effects of different treatments on explant sterilization, different hormone formulation on initial culture of explant and rooting of tissue culture seedling, were studied, usingActinidiachinensisstem with axillary bud as explant. The results showed that the best sterilizaiton treatment was 75% alcohol for 30 s firstly, and then 0.1% Mercury(II) chloride for 8 min, and the survival rate of explant reached 88%. The optimum initial culture medium was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L, the budding rate of which was 92%. The optimum rooting culture medium was 1/2 MS+IBA 0.15 mg/L+NAA 0.3 mg/L, with 85.6% of the rooting rate.

Actinidiachinensis; stem; tissue culture; sterilization conditions; hormone formulation; budding; rooting

2016-08-07

黄宝菊，女，1988年生，研究实习员。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.10.001