适用于冬虫夏草和新疆虫草鉴别的DNA条形码技术研究＊

马红梅，于 静，戴 明，张 帆

（1. 新疆医科大学中医学院 乌鲁木齐 830054；2. 新疆医科大学维医学院 乌鲁木齐 830054；3. 川北医学院药学院 南充 637000）

适用于冬虫夏草和新疆虫草鉴别的DNA条形码技术研究＊

马红梅1，于 静2，戴 明1，张 帆3＊＊

（1. 新疆医科大学中医学院 乌鲁木齐 830054；2. 新疆医科大学维医学院 乌鲁木齐 830054；3. 川北医学院药学院 南充 637000）

目的：应用DNA条形码技术对青海冬虫夏草和新疆虫草进行鉴别，考查ITS序列和18S序列作为DNA条形码的可行性。方法：利用ITS序列和18S序列对冬虫夏草和新疆虫草的DNA提取物进行PCR扩增并测序，并与GenBank数据库中下载的共23条近缘虫草的ITS序列和18S序列进行比对；利用MEGA 6.0分析软件计算的K-2-P距离，构建虫草样品和参比序列的18S、ITS序列的NJ树。结果：通过遗传距离和NJ树分析可知，本研究所用20份青海冬虫夏草和新疆虫草样本确定为虫草类，与其近缘虫草各自聚为一支；ITS序列构建的NJ树能够从种属水平上将青海冬虫夏草和新疆虫草成功鉴别开来。结论：ITS序列较18S序列更适合作为冬虫夏草和新疆虫草的条形码进行鉴定研究。

冬虫夏草 新疆虫草 DNA条形码 ITS序列和18S序列

冬虫夏草是中国特有的名贵中药材，主产于海拔3 000-5 000 m的高山草甸区，多产于四川、青海、西藏、云南、贵州等地，冬虫夏草Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc是麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及其幼虫尸体的复合体，具有壮阳滋阴、滋补身体的功效，还具有调节免疫、内分泌、呼吸系统功能、肝脏功能等多种药理作用[1]。新疆虫草以阿尔泰山森林带和伊犁地区为主要产地，哈萨克民间习用，一般多是僵虫。新疆虫草为麦角科虫草属真菌新疆虫草菌Cordyceps grsacilis（Grev.）Dur et Mont的子座及其寄主蝙蝠蛾科阿尔泰蝠蛾昆虫幼虫及幼虫尸体的复合体[2]。新疆虫草与冬虫夏草为同属真菌，从亲缘关系上是中国各种虫草和蛹草中最接近冬虫夏草的药材，临床功用相似。

近年来，虫草市场常出现以次充好、掺假充真的混乱现象，常见用价格相对较为便宜的新疆虫草冒充冬虫夏草，或以伪品冒充冬虫夏草正品。这些影响了虫草药材规范管理，也严重影响了消费者身体健康。新疆虫草和冬虫夏草的鉴定成为首要解决的问题，建立快速鉴别、鉴定新疆虫草与冬虫夏草的方法是中药材市场规范化丞待解决的需求。

本研究运用在菌物条形码中应用较多的ITS[3，4]、18S两种序列对冬虫夏草和新疆虫草进行鉴定研究，考察两种DNA条形码候选序列的鉴定能力，为冬虫夏草种属DNA分子鉴定研究提供参考依据。

1 仪器材料和方法

1.1 仪器和材料

TGL-16B台式离心机（上海安亭科学仪器制造厂），GL-88B漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），K20干式恒温器（杭州美盛仪器有限公司），K5500核酸蛋白定量仪（北京凯奥科技发展有限公司），DYY-6C电泳仪电源（北京市六一仪器厂），DYCZ-21电泳槽（北京市六一仪器厂），MyCycler Thermal Cycler梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司），凝胶成像系统BioDoc-IT Imaging System（美国UVP公司）；CTAB（北京中生瑞泰科技有限公司，批号：20120416247），DYCP-31DN及DYY-6C型 水平电泳仪及电源（北京市六一仪器厂），移液器（德国Eppendorf公司，10 -1 000 μL）。

NaCl（天津福晨化学试剂厂，批号：XK13-011-00030），EDTA（AMRESCO，批号：1926B030），琼脂糖（上海生工有限公司，批号：AB0013），异丙醇（天津市富宇精细化工有限公司），无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司），氯仿（天津市富宇精细化工有限公司），异戊醇（天津市富宇精细化工有限公司），50×TAE（生工生物工程股份有限公司，批号：SD8101-500 mL），Tris-HCl（北京索莱宝科技有限公司，批号：201203169521），Marker DL2000（日 本 Takara公 司，批 号：3427A），6×Loading buffer（日本Takara公司，批号：9156），Pfu DNA Polymerase（北京天根生化科技有限公司，批号：EP101），Super Pure dNTP Mix（北京天根生化科技有限公司，批号：CD111），Agarose（生工生物工程股份有限公司，批号：AB0013-250 g），50×TAE buffer（生工生物工程股份有限公司，批号：SD8101-500 mL），Ethidium Bromide（美 国Sigma公司，批号：E8751），PCR引物由上海生工有限公司合成。

实验所用青海冬虫夏草（10份，编号：QH-11至QH-20），新疆虫草（10份，编号XJ-1至XJ-10）购自乌鲁木齐市百草堂医药连锁有限公司，分别由新疆医科大学中医学院李永和教授鉴定来源分别为冬虫夏草Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc、新疆虫草Cordyceps grsacilis（Grev.）Dur et Mont。

1.2 实验方法

1.2.1 样品DNA提取

取30 mg虫草，加入液氮充分研磨，采用CTAB法提取虫草DNA基因组[5]。

1.2.2 DNA的纯度、浓度检测

取将DNA提取液适当稀释后，用核酸蛋白定量仪及琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 PCR扩增和测序

实验采用两对正反向引物（ITS5、ITS4），（18SF、18SR）。

（1）PCR反应体系

反应体系为30 μL，分别包含10×Pfu Buffer 3 μL、dNTP Mix（10 mM） 0.6 μL、Primer F（10 μM）0.6 μL、Primer R（10 μM）0.6 μL、Template 0.6 μL、Pfu DNA Polymerase（2.5 U·μL-1）0.3 μL、ddH2O224.3 μL。

（2）PCR反应程序（序列ITS5、ITS4）

循环参数为变性95℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸 72℃ 60 s，40个循环。首次循环前预变性95℃ 5 min，最后一个循环后 72℃延伸5 min。

（3）PCR反应程序（序列18SF、18SR）

循环参数为变性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸 72℃ 60 s，40个循环。首次循环前预变性95℃ 5 min，最后一个循环后72℃延伸5 min。

（4）PCR产物检测与测序

PCR产物电泳后使用凝胶成像仪观察，将扩增成功的PCR产物送到上海生工有限公司测序。

1.2.4 种间及种内序列差异比较[6]

用ClustalX 2.0 校对拼接，去除低质量序列及引物区，进行多序列比对并人工校验，得到完整的各DNA条形码序列。利用DNA-STAR软件分析得到各序列长度及碱基组成，进行序列比对，在数据库NCBI中查找冬虫夏草同属真菌的ITS序列和18S序列作为参比序列，用MEGA 6.0计算K-2-P距离，对不同序列种间、种内变异大小进行比较，构建其NJ树，评价不同序列的鉴定能力。

2 结果与分析

2.1 DNA纯度及浓度检测结果

经CTAB法提取DNA的纯度在（1.90±0.10）之间，见表1。结果表明：CTAB法提取的DNA样品符合后续PCR扩增要求。

2.2 PCR产物检测

对20个样品进行PCR扩增，同时增加阴性对照[7]， 样品ITS扩增成功率达100%，PCR纯化产物均在600 bp左右，特异性片段大小适中，便于测序以及后续的序列分析（图1）。20个样品的18S扩增成功率达95%，PCR纯化产物均在2 000 bp左右（图2）。

表1 新疆虫草和冬虫夏草样品的浓度检测结果

图1 ITS引物对20个虫草样本的PCR扩增图谱

图2 18S引物对20个虫草样本的PCR扩增图谱脱曲线

2.3 构建系统进化树

利用MEGA 6.0分析软件计算的K-2-P距离，构建虫草样品和参比序列的18S、ITS序列的NJ树。在GenBank数据库中下载的共23条新疆虫草和冬虫夏草样品的18S、ITS参比序列。应用MEGA6.0软件对ITS序列、18S序列构建系统进化树（图3、图4）。

由图3和图4可知，在ITS序列构建的NJ树中，青海冬虫夏草样品QH-12、QH-13、QH-19和甘肃冬虫夏草（EU570952.1）、四川冬虫夏草（EU570959.1）聚为一支，支持率为86%；QH-11、QH-15和QH-17聚为一支，支持率为96%；QH-16、QH-18和QH-20聚为一支，支持率为98%；新疆虫草XJ-7、XJ-9聚为一支，支持率为91%；新疆虫草XJ-2、XJ-6、XJ-10与挪威细蛇形虫草（AJ786563.1、AJ786564.1）聚为一支，支持率为92%。在18S序列构建的NJ树中， XJ-1、XJ-9和XJ-10聚为一支，支持率为99%；XJ-4、XJ-8和XJ-7聚为一支，支持率为100%。青海冬虫夏草和新疆冬虫夏草的ITS序列和18S序列的NJ树中可以看到它们均可各自与亲缘关系较近的同属虫草或近缘属虫草聚为一支而得以区分鉴别，但是18S序列构建的NJ树与参比序列支持率较低，聚类结果不理想。

图3 利用ITS序列构建系统进化树

图4 利用18S序列构建系统进化树

3 讨论

DNA条形码技术广泛应用于动植物的鉴别研究，而真菌类生物的条形码研究尚处于初级阶段。目前，本研究中的新疆虫草和冬虫夏草，在早期研究中采用的是生药学特征、形态学[1]、理化显微鉴别、特异性PCR鉴定[8]、RAPD多态性分析[9]等鉴别方法，现在则是应用DNA条形码技术进行鉴别。如陈抒云等[10]结合ITS序列和COI序列的DNA条形码技术鉴定凉山虫草与其近缘物种及其混伪品。王薇等[11，12]将ITS序列作为DNA条形码在虫草鉴定及系统发育关系中的研究和应用中，认为ITS序列作为虫草DNA条形码是可行的。Xiang L等[13]将ITS作为DNA条形码序列进行分析和评估快速，准确鉴定了131份冬虫夏草样品和12种常见近缘伪品。张文娟等[14]将ITS1作为DNA条形码用于冬虫夏草与其近缘种的鉴别，以达到借助ITS1序列鉴定冬虫夏草及其同属的混伪品的目的。本研究在参考文献的基础上，重点解决新疆虫草和冬虫夏草的鉴别问题以及两种药材的真假问题。本实验采用DNA条形码技术，选取ITS序列和18S序列进行分析，比较两种序列的鉴定能力，最终选取适合于新疆虫草和冬虫夏草的特征序列片段，建立针对新疆虫草和冬虫夏草的快速、准确鉴别方法。

DNA条形码序列鉴定方法的准确性，是指无论根据ITS序列构建的NJ树，还是各物种的种内、种间的遗传距离，均能准确鉴定其基原物种并进行聚类区分。各虫草物种的ITS序列虽长度不同，但种内变异小，种间差异比较大，从而使种间与种内变异有个很好的界定，能将冬虫夏草与其他虫草区分开来[10]。本研究所用青海冬虫夏草和新疆冬虫夏草从NJ树种可知，实验样本来源于虫草类，与其近缘虫草各自聚为一支。通过对其进行ITS序列和18S序列作为条形码的研究，发现ITS序列作为冬虫夏草和新疆虫草的条形码较18S序列更为适合，ITS序列的有效长度为600 bp左右，片段长度大小适宜，扩增与测序成功率为100%；基于ITS序列构建的青海冬虫夏草及新疆虫草的NJ树可以看出：青海虫草各自聚为一支，新疆虫草各自聚为一支，两者可以得到区分，这说明基于ITS序列构建的NJ进化树能很好地区分冬虫夏草及新疆虫草。

本研究以青海冬虫夏草、新疆虫草及其亲缘关系较近的同属虫草、近缘属虫草为例，构建系统树，筛选出较好区分冬虫夏草和新疆虫草的ITS序列，该方法可应用于药材市场中青海冬虫夏草与新疆虫草的鉴别，为保障临床安全用药提供了新的技术手段。

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Study on DNA Barcoding Technology of Qinghai Cordyceps Sinensis and Xinjiang Cordyceps Grsacilis for Identification

Ma Hongmei1,Yu Jing2,Dai Ming1,Zhang Fan3

(1. Chinese Medicine College,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China; 2. Traditional Uighur Medicine College,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China; 3.School of Pharmacy,North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China)

This study aimed to identify Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc from Qinghai Province and Cordyceps grsacilis (Grev.) Dur et Mont from Xinjiang Uygur Autonomous Region by DNA barcoding method. The feasibility of ITS sequence and 18S sequence was examined as a DNA barcoding. The DNA samples were extracted and purified. The PCR amplification and bidirectional sequencing of the materials were carried out to obtain ITS and 18S sequences. Then ITS and 18S sequences achieved together with 23 ITS and 18S sequences from GenBank database were aligned. MEGA program (version 6.0) was employed to calculate K2P and built NJ trees of ITS and 18S sequences. From the analysis of the experimental data,the 20 samples in this study were almost clustered together as its closely related genera formed a monophyletic group. The NJ tree constructed by ITS sequencescan identify the two species of Cordyceps in the species’ level. It was concluded that the ITS sequence was more suitable for the identification of Qinghai Cordyceps sinensis and Xinjiang Cordyceps grsacilis compared with the 18S sequence.

Cordyceps sinensis,Cordyceps grsacilis,DNA barcoding,ITS and 18S sequences

10.11842/wst.2016.05.018

R282.5

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-01-11

修回日期：2016-02-24

＊ 国家自然基金委地区科学基金项目（81460637）：利用“组分中药”模式探讨哈萨克药材准噶尔乌头在体内的毒性标记物，负责人：张帆；新疆医科大学校级科研创新基金项目（XJC201312）：基于DNA条形码技术的新疆虫草、冬虫夏草的鉴定，负责人：马红梅。

＊＊ 通讯作者：张帆，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：民族药综合利用。