产道定植B群链球菌的耐药性及耐药表型分析

雷蜜，倪维

(1.十堰市中医医院检验科，湖北 十堰 442000；2.湖北省中医院检验科，湖北 武汉 430074)

产道定植B群链球菌的耐药性及耐药表型分析

雷蜜1，倪维2

(1.十堰市中医医院检验科，湖北 十堰 442000；2.湖北省中医院检验科，湖北 武汉 430074)

目的 了解孕晚期妇女产道定植B群链球菌(GBS)的检出率、耐药率及耐药表型。方法纳入2014年1月至2015年12月167例产道定植筛查GBS阳性的样本，用美国国家临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的纸片扩散法检测GBS耐药性，用红霉素、克林霉素双纸片法(D试验)检测GBS耐药表型。结果GBS检出率为12.8% (167/1 300)；对红霉素耐药率为63.5%(106/167)，克林霉素为51.5%(86/167)，左氧氟沙星为38.9%(65/167)，四环素为88.0%(147/167)，并呈现耐药性上升趋势；对万古霉素、头孢噻肟、青霉素G、氨苄西林、利奈唑胺均未出现耐药。D试验检测GBS耐药表型，结构型占51.5%(86/167)，诱导性型占5.4%(9/167)，泵出型占6.6%(11/167)。结论青霉素和氨苄西林仍可作为围产期孕妇预防和治疗B群链球菌感染的首选用药；应加强GBS诱导型克林霉素耐药的检测，以指导围产期孕妇青霉素高危过敏时临床医生合理使用大环内酯类、林可酰胺类抗生素。

B群链球菌；产道定植；耐药；D试验

B群链球菌(group B streptococcu，GBS)又名无乳链球菌，常寄生于阴道和直肠，以荚膜多糖为主要致病因子，为兼性厌氧的革兰阳性条件致病菌。健康人群的GBS带菌率可达15%～35%，妊娠妇女的带菌率可达10%～30%[1-2]；GBS是围产期孕妇感染排在首位的致病菌[3]，易导致产妇泌尿生殖道感染、产褥感染、败血症和早产等，美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)统计40%～70%的GBS感染通过母婴传播，会诱发新生儿肺炎、败血症、脑膜炎等，死亡率高，GBS感染是新生儿的严重感染性疾病之一[4]。为及时有效的预防和治疗GBS感染，十堰市中医医院(以下称“我院”)对孕晚期妇女(35-37W)进行产道定植GBS筛查，分析GBS阳性菌株耐药性及耐药表型，为临床提供准确用药依据，指导临床合理使用抗生素，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年1月至2015年12月在我院自愿接受产道定植GBS筛查的孕晚期妇女(35～37周)1 300例。按照2010年CDC《预防早发性GBS感染操作规范》[5]推荐的取材方法，以无菌棉签先深入阴道下1/3深部再经过肛门括约肌(不借助诊视器)，取得其孕晚期妇女阴道-肛周分泌物拭子(参与筛查者近期均无性交且未使用抗生素)。

1.2 GBS筛查方法 选择《预防早发性GBS感染操作规范》推荐的显色肉汤培养法，按照《全国临床检验操作规程》(第四版)规范操作。将取得的分泌物拭子直接接种于GranadaTM-T增菌肉汤(法国生物梅里埃公司)中，在35℃培养24 h后肉汤由清亮变为橙红色为GBS阳性；没有变色的肉汤需转种到血平板(郑州安图生物工程公司)35℃空气或5%CO2条件下孵育18～24 h，以排除假阴性。最后CAMP阳性，杆菌肽和复方新诺明耐药，马尿酸盐阳性，用协同凝集血清学试验(Lancefield抗原血清学分型法国生物梅里埃公司)，进行菌株种群鉴定。

1.3 体外药敏试验 GBS的药敏试验根据美国国家临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的纸片扩散法(K-B法)，并选择药敏谱[6]：青霉素G、头孢噻肟、氨苄西林、红霉素、克林霉素、万古霉素、四环素、左氧氟沙星、利奈唑胺(英国Oxoid)。药敏质试验控对照菌株肺炎链球菌ATCC49619(购于湖北省临检中心)。血M-H琼脂购于郑州安图生物工程公司。

1.4 耐药表型检测 按照CLSI标准[7]，制备0.5麦氏比浊浓度的GBS新鲜悬液涂布于血M-H琼脂平板上，在相距15 mm和12 mm处(边缘到边缘)贴上红霉素和克林霉素纸片，35℃空气或5%CO2条件下孵育18～24 h，观察结果。若红霉素耐药，克林霉素敏感，发现克林霉素的抑菌圈靠近红霉素一侧钝圆，形似大写字母D，则为D试验阳性，为诱导型(iMLS)耐药；若克林霉素仍为圆形，则为D试验阴性，为泵出型(MS型)耐药，若红霉素和克林霉素均耐药，则为结构型(cMLS)耐药。D试验阳性时应在报告中注释：“基于诱导型克林霉素耐药检测，推定该菌对克林霉素耐药。”

1.5 统计学方法 采用WHONET5.6进行数据搜集，应用SPSS17.0统计软件进行数据整理分析，采用χ2检验进行显著性比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GBS检出率 1 300例孕晚期妇女阴道-肛周分泌物标本共检出GBS 167例，检出率为12.8% (167/1 300)。

2.2 GBS药敏试验结果 如表1所示，GBS对红霉素耐药率为63.5%，克林霉素为51.5%，左氧氟沙星耐药率为38.9%，四环素耐药率为88.0%，未发现对头孢噻肟、青霉素G、氨苄西林、万古霉素、利奈唑胺均耐药菌株。且2014-2015年，GBS对红霉素、克林霉素、四环素和左氧氟沙星耐药率均呈不同程度的上升趋势。

表1 167株GBS对常用抗菌药物耐药性分析[株(%)]

2.3 耐药表型检测结果

2.3.1 红霉素和克林霉素耐药性比较 167株GBS红霉素和克林霉素药敏结果一致的共147株，另有20株对红霉素耐药但对克林霉素仍敏感。克林霉素和红霉素耐药和(敏感+中介)数据运用四格表格卡方独立检验得出结论：GBS对红霉素和克林霉素的耐药具有较高的一致性(χ2=102.04，P＜0.01)。

2.3.2 D试验检测GBS耐药表型 167株GBS中红霉素耐药共106株，对红霉素和克林霉素均耐药的菌株有86株，则cMLS占51.5%；红霉素耐药克林霉素敏感菌株共20株，D试验阳性9株，则iMLS占5.4%；D试验阴性11株，则MS占6.6%。

3 讨 论

据称有50%～65%的阳性孕妇可在宫内或分娩时将B群链球菌传播给新生儿，从而成为诱发新生儿感染的潜在因素[7]。目前，国外已经把孕晚期妇女产道GBS定植筛查作为产前检查的常规项目进行，在我国很多地区由于各种因素还没有开展，十堰地区产道定植B群链球菌流行病学资料缺乏。本研究的样本采样时间、取材方法、筛查方法等均按照美国CDC指南要求进行，并遵循CLSI的标准进行药敏试验，旨在了解本地区孕晚期妇女产道定植GBS的检出率、耐药率及耐药表型分离情况。国外有研究表明孕妇GBS的带菌率可达到5%～30%[8]，我国文献报道，母体GBS带菌率为3.4%～15.8%[9-10]。本研究显示孕晚期妇女阴道-肛周分泌物标本GBS检出率为12.8%(167/1300)。对167株GBS进行药敏试验，GBS对万古霉素、青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、利奈唑胺均未出现耐药，对红霉素耐药率为63.5%，克林霉素为51.5%，左氧氟沙星为38.9%，四环素为88.0%。2010年CDC在预防指南中[5]建议对孕晚期筛查GBS阳性的孕妇预防和治疗推荐使用的首选药物为青霉素和氨苄西林。本研究结果显示孕妇产道GBS分离株对青霉素和氨苄西林100%敏感，仍可作为围产期妇女预防和治疗GBS感染的首选用药。青霉素抗菌谱窄，在一定程度上可减少耐药情况的发生；氨苄西林是的抗菌谱相对较广，为备选用药。

国外有报道称，约10%的产前筛查GBS阳性的孕妇青霉素过敏，需要选择其他药物来治疗[11]。对于青霉素过敏的患者若非速发型过敏反应者使用头孢唑啉，因其穿透胎盘方式与青霉素相似；若为对青霉素过敏显示高风险的速发型超敏反应，推荐使用红霉素和克林霉素治疗[5]。红霉素和克林霉素为MLSB类抗生素，即大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B复合物类抗生素。这类抗生素虽然化学结构不同但对细菌的蛋白合成的抑制作用相似，而且临床适应证广，不良反应少，更因其可用于治疗青霉素过敏患者而被广泛使用。但对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉敏感的GBS菌株，可能对克林霉素和红霉素耐药，本研究比较了红霉素和克林霉素的耐药情况，显示红霉素和克林霉素耐药具有较高的一致性，鉴于GBS对MLSB抗生素已存在较高比例的交叉耐药现状，因此在临床应用上应当避免重复选择MLSB类抗生素。

当从严重青霉素过敏妊娠妇女阴道-肛周分泌物标本分离到GBS时，必须对红霉素和克林霉素进行药敏试验，并检测克林霉素诱导耐药表型，为青霉素高危敏感者提供预防和治疗的用药依据。根据红霉素和克林霉素药敏结果和D试验结果来检测耐药表型：同时耐药为结构型(cMLS)耐药；当红霉素耐药而克林霉素敏感时，需用D试验区分诱导型(iMLS)和泵出型(MS型)耐药，D试验阴性为泵出型(MS型)耐药，D试验阳性表明为诱导性(iMLS)耐药。本研究纳入的167例GBS阳性菌株，共筛选出红霉素和克林霉素均耐药86株，则cMLS型占51.5%；D试验阳性9株，则iMLS占5.4%；D试验阴性11株，则MS型占6.6%。MS型可选择克林霉素治疗，而iMLS型选择克林霉素会治疗无效。当克林霉素耐药，或为药敏结果未知时，应选择万古霉素治疗[5]。本研究显示克林霉素诱导耐药的占比为5.4%，在对GBS的预防和治疗时应引起足够重视。

综上所述，GBS是孕产妇和新生儿感染的重要致病菌，青霉素和氨苄西林仍可作为围产期妇女预防和治疗B群链球菌感染的首选用药；应加强诱导型克林霉素耐药检测，以指导青霉素高危过敏的围产期妇女B群链球菌感染时临床医生合理使用大环内酯类、林可酰胺类抗生素。

[1]Ronald SG,Stephanie S,Anne S.Perinatal infections due to group B streptococci[J].Obster Gynecol,2004,104(5):1062-1076.

[2]Curry L,Mahmood TA,Hughes R.The ethics of screening for group B streptococcus in pregnancy[J].Obstet Gynecol,2014,24(2): 62-64.

[3]蔡晓沂,钟镐镐,王秀艳,等.快速、准确的B群链球菌检测-即时荧光探针核算扩增技术的应用[J].现代预防医学,2013,40(13): 2533-2535,2546.

[4]朱敏,范建霞,程利南.围产期B族链球菌感染的研究进展[J].中华妇产科杂志,2005,40(2):137-141.

[5]Varain JL,Schrag SJ.Prevention of perinatal group B streptococcal disease.Revised guidelines from CDC,2010[J].MMWR Recomm Rep,2010,59(RR/10):1-36.

[6]Cockerill FR.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing:Twenty-Second Informational Supplement[M].Clinical and Laboratory Standards Institute,2014:109-152.

[7]Valkenburg-Vand BAW,Houtman-Roelofen RL,Oostvogel PM,et al. Timing of group B streptococcus screening in pregnancy:a systematic review[J].Gynecologic and Obstetric Investigation,2010,69(3): 174-183.

[8]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].Sixteenth informational supplement M 100-S16.Wayne,Pennsylyania,2006.

[9]时春燕,曲首辉,杨慧霞,等.妊娠晚期孕妇B族链球菌带菌状况的检测及带菌对妊娠结局的影响[J].中华妇产科杂志,2010,45(1): 12-16.

[10]应群华,严文卫,丁金龙.围产期生殖道菌群检测和B群链球菌筛查[J].中国微生态学杂志，2006,18(6):491-492.

[11]Paccione KA.Wiesenfeld HC.Guideline abherence for intrapartum group B streptococci prophylaxis in penicillinallergic patiwnts[J].Infect Dis Obstet Gynecol,2013,2013:917304.

Analysis of drug resistance and drug resistance phenotype of group B Streptococcus for vaginal colonization.

LEI Mi1,NI Wei2.1.Department of Clinical Laboratory,Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442000, Hubei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Hubei Provincial Hospital of TCM,Wuhan 430074,Hubei,CHINA

ObjectiveTo understand the detection rate,the rate of drug resistance,and resistance phenotypes of group B Streptococcus(GBS)for vaginal colonization.MethodsA total of 167 samples found positive for GBS in vaginal colonization screened from January 2014 to December 2015 were collected.Disk diffusion method recommended by Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)was used to detect the drug resistance of GBS.Double disk diffusion(D test)for erythromycin and clindamycin was used to detect resistant phenotype of GBS.ResultsThe detection rate of GBS was 12.8%(167/1 300).GBS were resistant to erythromycin(63.5%,106/167),clindamycin(51.5%,86/167),levofloxacin(38.9%,65/167)and tetracycline(88.0%,147/167),showing a rising trend of drug resistance.There was no resistance to vancomycin,cefotaxime,penicillin G,ampicillin and linezolid.D test showed the resistant phenotypes of GBS included structure type(51.5%,86/167),induced type(5.4%,9/167),pump out type(6.6%,11/167).ConclusionPenicillin and ampicillin can be used as the first choice for the prevention and treatment of group B streptococcal infection.We should strengthen the detection of resistance to clindamycin in GBS,in order to guide the rational use of antibiotics in pregnant women with penicillin allergy,such as macrolides and lincosamides.

Group B streptococcu;Vaginal colonization;Resistance;D-test

R378.1+2

A

1003—6350（2016）19—3121—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.19.008

2016-04-27)

国家自然科学基金(编号：81573815)

雷蜜。E-mail：6518596@qq.com。