液体培养条件对白僵菌代谢物产量的影响

樊金华，薛皎亮，张虎芳，谢映平

(1.山西农业大学 林学院，山西 太谷 030801； 2.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；

3.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)



液体培养条件对白僵菌代谢物产量的影响

樊金华1，薛皎亮2，张虎芳3，谢映平2

(1.山西农业大学 林学院，山西 太谷 030801； 2.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；

3.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

摘要：白僵菌代谢产物可以大大提高靶标害虫的杀虫效果，揭示菌株培养条件与代谢物产量之间的关系对于代谢物的大量提取具有重要意义。本研究采用正交试验对白僵菌2382菌株的培养基初始pH值、培养时间、培养温度和转速4个培养条件与代谢物产量之间的关系进行了研究。结果表明:各因子对白僵菌液体培养代谢物产量影响的强弱排序为培养基初始pH值>培养时间>培养温度>转速，白僵菌液体培养代谢物产量最佳的培养条件为：初始pH值5.0、培养时间10 d、培养温度30 ℃、转速140 r·min-1。该研究为大批量提取白僵菌代谢产物及其在害虫生物防治中的应用提供了科学依据。

关键词：布氏白僵菌；液体培养；正交试验；次生代谢产物

虫生真菌是指寄生于昆虫和蜘蛛的真菌，全世界已经记载的约有800多种，在我国已经发现400多种，其中寄生昆虫的真菌就有215种[1]。已有的研究表明，这些虫生真菌不仅具有杀虫的作用，而且其产生的代谢产物也具有重要的生物学活性。例如虫生真菌代谢产物具有药用价值[2]、可以对植物的真菌性病害起到抑制作用[3]、促进小麦胚芽鞘的伸长生长[4]、具有杀线虫和杀虫活性[5,6]。因此，虫生真菌代谢产物的研究越来越引起人们的关注。

有研究表明，寄主昆虫的免疫抵抗作用是虫生真菌防治效果不稳定的一个重要因素。当金龟子幼虫被注入绿僵菌大孢变种(Metarhiziumanisopliaevar. major)后，敏感种白金花金龟子的幼虫体内则形成松散的包囊体，孢子可顺利地萌发和生长；免疫种铜绿丽金龟子(AnomalacorpulentaMotschul)和华北大黑鳃金龟子(Holotrichiaoblita)的幼虫体内形成典型结构的包囊体，其内部是黑化的不能萌发的绿僵菌孢子[7]。虫生真菌次生代谢产物在抑制宿主的免疫活性方面发挥着重要的作用。Bandani 报道了霉菌Tolypocladiumcylindrosporum及其代谢产物 efrapeptins 能够影响大蜡螟GalleriamellonellaL. 幼虫的免疫系统，感染后的昆虫血细胞总数在前24 h保持恒定，在接下来的24 h明显下降[8]。

国内外有报道表明，虫生真菌次生代谢产物主要有白僵菌素(Beauverolides)、卵孢霉素(Oosporein)、环孢素(Cyclosporin)和破坏素(Destruxins)等[9]。但是，这些次生代谢产物主要为多肽或蛋白类，而对次生代谢产物中小分子化合物的研究报道还很少。与多肽或蛋白类物质相比，小分子化合物具有更稳定的物理和化学性质，更有可能成为天然昆虫免疫抑制剂的潜在来源。因此，虫生真菌代谢产生的小分子化合物的研究引起了人们的广泛关注。

至今，关于真菌液体培养条件的研究主要集中在孢子产量、生物量和微菌核[10]的产生方面，而对培养条件与代谢物产量之间的关系方面的研究还未见报道。2008年，本课题组从布氏白僵菌发酵液中分离得到了对松毛虫免疫活性具有抑制作用的菌株小分子代谢产物粗提物，经过气质联用分析证明了其中的主要组分为2-哌啶酮和2-香豆满酮[11,12]。为了获得大量的菌株代谢产物，本研究利用正交试验对布氏白僵菌液体培养代谢物产量的条件进行优化。该研究可为昆虫免疫抑制剂的大量提取，及其在有害昆虫生物防治中的应用提供科学依据。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1菌株

本项研究采用课题组于2006年3月，在河北承德油松林内采集的油松毛虫幼虫死亡虫体上分离并鉴定得到的一株布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)作为菌种[13]，该菌株同时保藏在北京国家菌种保藏中心，编号2382。

1.1.2仪器及试剂

恒温摇床(Thermo MAX 低温摇床)；电子天平(岛津AY120，日本岛津公司)；低速大容量离心机(上海安亭)；真空干燥箱(上海福玛实验设备有限公司DZX-3)。蛋白胨、酵母浸出膏(奥博星，北京奥博星生物技术有限责任公司)；葡萄糖、乙醇、乙酸乙酯(风船，天津市风船化学试剂科技有限公司)。

1.2　菌株孢子悬液的制备

将布氏白僵菌2382菌株接种在PDA培养基上，(25±1) ℃，75% RH的条件下培养10 d。将孢子粉悬浮于无菌的0.01%吐温80水(v/v)中，制成浓度为1×107孢子·L-1的孢子悬液。

1.3　液体培养

培养基：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出膏10 g·L-1，葡萄糖40 g·L-1，蒸馏水定容到1000 mL。

接种和培养：液体培养用500 mL的三角瓶，每瓶装入液体培养基200 mL，灭菌后接种。接种量为每瓶接种1 mL孢子悬液。然后在恒温摇床上(25±1) ℃培养。每个试验设3个重复。

1.4　培养条件优化的正交试验设计

根据白僵菌的生长特点，选择培养时间、培养基初始pH值、转速、培养温度4个因子，每个因子在3个水平下对白僵菌进行液体培养条件正交试验并作方差分析，因素水平设计见表1。

表1　正交试验因素水平表

1.5　菌株代谢产物的测定

采用胡丰林(2006)的方法[14]。发酵液经浓缩、醇沉、萃取、所得有机相浓缩干燥，得到深红色粉末即为菌株的代谢产物，用电子天平称量。

1.6　统计分析

运用SPSS 16.0软件进行统计分析和差异显著性检验。

2结果与分析

2.1　培养条件对白僵菌代谢产物的影响

试验结果显示，4个因子在白僵菌液体发酵代谢物产量中均产生了影响，但各因子的影响程度不同(表2，表3)。根据F值将各因子对白僵菌液体发酵代谢物产量影响强弱排序为B>A>D>C，即初始pH值>培养时间>培养温度>转速。

表2　培养条件对白僵菌代谢物产量影响的正交试验结果

表3　培养条件对白僵菌代谢物产量影响方差分析

2.2　培养时间对白僵菌代谢物产量的影响

试验结果显示，培养时间的长短对白僵菌代谢物产量的影响显著(表4)，在培养到第10 d时，代谢物产量达到最大值为(0.123±0.105) g，且与其他时间点的产量差异显著(P<0.05)。所以白僵菌液体发酵代谢物产量的最佳培养时间为10 d。

表4培养时间对白僵菌代谢物产量的影响差异显著性比较

Table 4Difference analysis of metabolite production ofBeauveriabrongniartiistrain 2382 from culturing time

水平号Levelnumber培养时间/dCulturingtime代谢产物/gYieldsofmetabolites150.066±0.022a2100.123±0.105b3150.071±0.037a

注：不同字母(a，b)表示水平间差异显著P<0.05。表5~表7同。

Note：Different letters mean significant difference (P<0.05). The same in table 5~7.

2.3　初始pH值对白僵菌代谢物产量的影响

培养基初始pH值对白僵菌代谢物产量的影响显著(表5)，在pH值为5.0时，产物量达到最大值(0.137±0.099) g，且与初始pH值为7.0和9.0的代谢物产量之间的差异达到显著水平(P<0.05)。所以白僵菌液体发酵代谢物产量的最佳培养初始pH值为5.0。

表5初始pH值对白僵菌代谢物产量的影响差异显著性比较

Table 5Difference analysis of metabolite production ofBeauveriabrongniartiistrain 2382 from the initial pH

水平号Levelnumber初始pH值InitialpH代谢产物/gYieldsofmetabolites15.00.137±0.099a27.00.064±0.028b39.00.059±0.017b

2.4　转速对白僵菌代谢物产量的影响

白僵菌液体发酵时转速对代谢物产量有影响(表6)。在转速为140 r·min-1时，产量达到(0.113±0.11) g，与转速为100 r·min-1时的产量差异显著(P<0.05)。所以白僵菌液体发酵代谢物产量的最佳培养转速为140 r·min-1。

2.5　温度对白僵菌代谢物产量的影响

培养温度对白僵菌液体发酵代谢物产量有显著影响(表7)，在30 ℃时，产量达到最大值为(0.120±0.106) g，且与温度20 ℃和25 ℃之间差异显著(P<0.05)。所以白僵菌液体发酵代谢物产量的最佳培养温度为30 ℃。

表6转速对白僵菌代谢物产量的影响差异显著性比较

Table 6Difference analysis of metabolite production ofBeauveriabrongniartiistrain 2382 from rotation rate

水平号Levelnumber转速/r·min-1Rotationrate代谢产物/gYieldsofmetabolites1100.00.058±0.016a2140.00.113±0.110b3180.00.089±0.032ab

表7培养温度对白僵菌代谢物产量的影响差异显著性比较

Table 7Difference analysis of metabolite production ofBeauveriabrongniartiistrain 2382 from culturing temperature

水平号Levelnumber温度/℃Culturingtemperature代谢产物/gYieldsofmetabolites120.00.070±0.019a225.00.070±0.040a330.00.120±0.106b

3结论与讨论

本文以布氏白僵菌2382菌株为研究对象，采用正交试验对该菌株液体培养条件对代谢产物的影响进行研究。结果显示，各因子对白僵菌液体发酵代谢物产量影响强弱排序为B>A>D>C，即初始pH值>培养时间>培养温度>转速。白僵菌液体发酵代谢物产量最佳培养条件为A2B1C2D3，在该条件下最大代谢产物量为(0.27±0.12) g。由此可知，在各因子中初始pH值对白僵菌液体发酵代谢物产量的影响较大。研究表明，真菌的最适产生孢子的生长温度一般为25 ℃。我们用单因素筛选方案对该菌株的产孢量的液体培养条件优化试验中，发现在培养温度为25 ℃条件下，菌株的孢子产量最大[15]。但是本研究表明该菌株液体发酵产生代谢产物的最佳温度为30 ℃，这说明菌株产生代谢产物和孢子的最佳培养温度存在差异。

正交试验设计与普通的多因素试验设计相比可以用较少的、有代表性的处理组合提供充分有用的信息。它在分析主效应与交互作用的同时大大减少了样本量及试验次数，是一种高效、灵活的多因素试验设计方法，因此被广泛应用于科学研究中[16]。本研究采用正交试验得到了白僵菌液体扩大培养产生代谢产物的最佳条件，大大方便了实验结果处理，使实验更加科学。郑卫星等[17]也运用SPSS软件设计L9(34)正交表并进行数据处理，得出中性蛋白酶水解提取林蛙油多糖的工艺。

总之，采用正交试验设计研究了白僵菌液体培养条件对菌株代谢产物的影响，证明了初始pH值对菌株液体发酵代谢物产量的影响较大并获得了最佳的发酵条件。该研究首次对液体培养条件对真菌代谢产物的影响进行了探讨，对优化虫生真菌代谢产物的发酵工艺，以及菌株代谢产物在生物防治中的大规模应用具有重要的意义。

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(编辑：梁文俊)

Effect of liquid fermentation conditions to the metabolite yield ofBeauveriaBrongniartii

Fan Jinhua1, Xue Jiaoliang2, Zhang Hufang3, Xie Yingping2

(1.CollegeofForestry,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China； 2.CollegeofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China; 3.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:Metabolites ofBeauveriacan greatly improve the insecticidal effect of pests, and study the relationship between culture conditions and metabolite production was very important for the massive extraction of metabolites. In this study, ,the relationships of the initial pH in culture media, culture times, culture temperature, and rotatory speed with the production ofBeauveriabrongniartii2382 metabolites were investigated by using orthogonal test. The results showed that the factors in liquid culture related to the secondary metabolite yield of the strain were the initial pH in culture media > culture times > culture temperature > rotatory speed. The optimum culture condition for secondary metabolite yield of the strain in liquid culture was: initial pH in culture media 5.0, cultured for 10 days, 30 ℃, and 140 r·min-1. The study provided a scientific basis for large batch extraction ofBeauveriabrongniartiimetabolites and the application of the biological control of pests.

Key words:BeauveriaBrongniartii; Liquid culture; Orthogonal test; Secondary metabolite

中图分类号：S476.12

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)01-0026-05

基金项目：山西省基础研究计划(青年科技研究基金)(2015021155);山西农业大学引进人才科研启动项目(2014YJ06)

作者简介：樊金华(1979-)，女(汉)，河北唐山人，讲师，博士，研究方向：害虫生物防治

收稿日期：2015-10-31修回日期：2015-11-30