激光共聚焦扫描显微镜技术简介及其应用

孙学俊，闫喜中，郝赤*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801; 2.阿尔伯特大学 医学院肿瘤研究所，加拿大 埃德蒙顿 T6G1Z2 )



★特约稿件

激光共聚焦扫描显微镜技术简介及其应用

孙学俊1,2，闫喜中1，郝赤1*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801; 2.阿尔伯特大学 医学院肿瘤研究所，加拿大 埃德蒙顿 T6G1Z2 )

摘要：激光共聚焦显微镜(共聚焦显微镜)是在生物学研究中最通用的荧光显微镜工具之一。它的广泛流行是因为其优越的光学切片和3维(3D)重建功能。不同于普通显微镜观测厚样本时由于被聚焦外光线干扰导致模糊图像，激光共聚焦显微镜可以从比较厚的生物样本在短期内获得清晰的光学切片。激光共聚焦显微镜所得到的一幅完全对齐的3D图像系列允许对样本在虚拟空间的任意角度观测。该技术越来越成为现代生命科学研究中必不可少的一项研究工具。本文的目的是为研究生和青年研究人员提供一些使用激光共聚焦显微镜的基础知识并对它的应用做简单的介绍。

关键词：荧光；共聚焦；显微镜；细胞影像；三维图像重组

显微镜可能是生物研究实验室中最古老的仪器之一。100多年以来，它的基本结构并没有多大的改变。随着各种增加图像对比度的显微镜技术的发明，比如相差显微技术( DIC , Differential Interference Contrast)、荧光显微镜技术等使显微镜成为现代科学研究中一项更必不可少的研究技术手段之一。然而没有一项显微镜技术的比激光扫描共聚焦显微镜(共聚焦显微镜)在生物学领域应用的影响大，共聚焦显微镜能够成为生物研究中最普遍的荧光显微镜工具无疑是基于其卓越的光学切片和三维重建的能力，该技术可以方便快捷地从比较厚的生物样品获得的清晰的光学切片，而且对样品的任何可能的角度可以作进一步的观测从而获得三维图像。随着共聚焦显微镜的日益发展，其复杂程度也日益增加，初学者或显微镜基础知识不足的科研工作者很容易犯一些技术性错误而得到错误的图像。该文章的目的是为相关科研人员和研究生阐述一些使用共聚焦显微镜最基本的知识，以及使用共聚焦显微镜基本设置的指导方针，了解其成像的基本原理，从而更有效地使用这项技术。该文对于影像专家可能过于简单，而初学者可能会发现它太复杂，作者希望通过本文让对该技术感兴趣的人对这项技术有一个基本的认识，并且掌握使用该技术的基本知识。总之，该文是一个典型的共聚焦显微镜培训的工作流程，也可以用作共聚焦显微镜培训的参考读物。

1现代宽视场显微镜和它的局限性

细胞是所有生命形态的基本构建模块，显微镜无论在细胞理论的形成还是在对细胞功能的研究中都起到了非常重要的作用。显微镜的分辨率可以由Abbe定律计算，即：

分辨率：d=1.22×λ/(NA物镜+NA聚光镜)

其中λ是光的波长；NA是数值孔径，定义了镜头的光收集能力：

NA =n×sinα

式中，“n”是透镜设计的介质的折射率， “α”是镜头可以收集的最大光锥的半角。数值孔径NA表达的是一个镜头的最基本的物理特性，它定义了镜头可以收集光的能力。透镜收集的光锥的半角越大，n越高，镜头收集光的能力越强。

对于荧光显微镜，Abbe定律可以简化为：

d=0.61×λ/NA

“d”为镜头的理论分辨率，有时也称为Airy单位(以记念 Sir George Biddel Airy，英国数学家、天文学家)，它是一个无限小的自发光物体在焦距平面上的第一衍射环的直径。显微镜镜头的分辨率通常被描述为可以分辨两个无限小的物体的最小距离(Rayleigh标准)。显微镜的镜头的分辨率通常是一个Airy单位，因为即使在最优化的状态下，两个无限小的物体的距离低于Airy单位时是不可能分辨开来的。显微镜镜头的分辨率是由该透镜的数值孔径(NA)和其采用的光的波长决定的。这一理论分辨率的极限已在18世纪后期达到[1]。然而，另一个主要光学显微镜的困惑一直到80年代中期都从来没有被真正地解决。显微镜的轴分辨率可以表达为：

d轴向=2×λ×n/(NA)2

轴向分辨率可以定义为透镜在Z轴可分辨的物体的最小距离。轴向分辨率通常是横向分辨率的1/3~1/2。而且通常，生物样品比显微镜能提供的光学厚度要厚很多。即使对于生命形式的基本构建模块细胞而言，其大小范围亦从几微米(如淋巴细胞)到几毫米(如神经元)不等。当把一个比较厚的标本放在显微镜镜头下观察，焦距外物体产生的光线会把焦距内的物体的结构完全遮蔽从而导致一副模糊的图像。因此，显微镜样本需要切成薄片，而且对分辨率要求越高，截面就需要越薄。对于一个典型的组织学切片，这种切片的厚度往往在几微米的范围内(最多约10 μm)。而大多数的生物样品的是三维的和相对较厚的，这就需要先把样品切片，之后再进行三维重建，过程非常繁琐和困难。80年代中期，Agard 和 Sedat[2]开创了一个叫反褶积的计算方案解决了这个问题。简单地讲，一个镜头的点扩散函数(PSF，一个无穷小的点光源在三维空间的分布)可以用摄像头拍摄低于镜头分辨率的物体来获取或者用数学模型来模拟，根据点扩散函数以及相机记录的图像来计算复杂物体的真实状态。这个迭代过程可以将焦距外光线重新“放回”它所处的位置。 最终计算出来的图像会增强对比度和减少焦距外光线的影响。在当时，反褶积被誉为所有光学显微镜的最终解决方案。然而，由于算法本身对计算机计算能力的超高要求，反褶积从来没有超出一些特殊的实验室的应用范围。

早在1957年，Marvin Minsky 就发明了共焦显微镜的基本概念，他使用一个针孔在显微镜的照明光路中，再用另一个针孔在共轭焦平面(因此称共聚焦)，由此焦距外的光线可以被针孔阻断，可以避免样品其他部位光的散射对图像造成影响，这样的显微镜会产生一幅比传统的显微镜(宽视场)更清晰的图像，当时该仪器的成像是通过移动样品台对样品进行扫描实现的。尽管该显微镜有明显的优势，且Minsky对该仪器的应用有非常有远见的预测[3]，但是第一台商用激光共聚焦显微镜在1987才上市[4]，之后才成为荧光显微镜领域的标准工具而得到广泛的接受。共聚焦激光扫描显微镜的设计与Minsky的初始设计非常相似，它使用一个针孔阻断焦距外光线和以栅格模式扫描试样成像(图1)。大多数的现代激光共聚焦显微镜用镜子来引导激光束代替样品台扫描，基本的设计与Minsky的设计类似：一个共焦针孔和光栅式扫描，最终该仪器实现了光学切片的功能；每次仅照明一个光衍射光斑，可以避免样品其他部分的光散射。这两个属性产生一个高对比度，没有焦距外光线的光学切片图像(图1)。此外，在适当的硬件和软件相结合下，该仪器可以自动获得样品经光学切片后重新在不同样品层次聚焦获取下一幅光学切片。如此重复， 共聚焦显微镜可以很快地获取样品完美的三维图像数据，在计算机辅助软件的帮助下可以对样品的三维结构以任意角度进行观察，使对三维的生物样品的观察变的非常容易，因此，共聚焦显微镜被广泛作为生物、医学研究的荧光显微镜的标准工具，也成为了广大科研院所的核心设施之一。

图1　宽视场显微镜和共聚焦显微镜的对比Fig.1　The comparison copy of wide and confocal microscopy　　注：示意图显示宽视场显微镜中(A)焦点内和焦点外的光都到达检测器而导致一幅模糊的图像(C)。在共聚焦模式(B)中，一个针孔(箭头)被放置在共轭平面。针孔只允许焦距内的光的通过并阻断聚焦外的光线，结果形成一幅高对比度的清楚图像(D)。C和D是在不同成像模式下对菊花花芽截面相同区域的荧光图像。箭头和*指示同一区域。注意在宽视场显微镜模式(C)，由于焦距外光线的干扰，基本看不到细节。Zeiss LSM710激光共聚焦显微镜， 63X/1.4油镜。 比例尺10 μm。Note:Diagram showing wide field microscope (A) where both out of focus light and in focus light were detected resulted in a blurred image (C). While in confocal mode (B), a pinhole aperture is placed in conjugate plane of the focus. It rejects out of the focus light and allows in focus light to be detected and results in a sharp image (D). Panel C and D are autofluorescence images from the same region of a flower bud cross section of Chrysanthemum. Arrow and arrowheads indicated the same region. Notice in wide field mode (C), details are lost due to out of the focus lights. Zeiss LSM710 CLSM with 63X/1.4 oil lens. Scale bar 10 μm.

2共焦激光扫描显微镜的缺点

激光共聚焦显微镜的点扫描特性注定该技术有一个缺点，图像是由单个像素扫描形成的，共聚焦显微镜是部相对缓慢的仪器。一幅典型的1 024*1 024像素的图像，用一个常用的2微秒每个像素点停留时间，形成一幅图像的时间长达超过2秒。此外，为了在一个合理的时间框架内得到一幅图像，共聚焦显微镜使用一个强大的激光光源，以减少像素点停留时间。这种光的强度通常比一个典型的宽场荧光显微镜荧光灯强度超过1 000倍以上。因此，光漂白是共聚焦显微镜的一个主要问题。通常一个合适的仪器参数的调整是这些因素的综合结果，我们将在接下来的几节详细讨论。

3高质量图象的判断

在讨论共聚焦显微镜图像采集之前，我们需要首先讨论如何定义一幅“好的图像”。对于科学的影像，它必须满足一些最基本的标准：丰富的科学内涵，是具有代表性的实验结果，没有缺陷和具有科学意义。虽然这些都是很难量化的硬标准， 但是一幅“好”的科学图片应该有：a)噪声低，图像的亮度是线性的而且没有饱和的像素 ；b)没有标记的区域应该尽可能接近黑色。对图像质量的一个非常简单的评估方法是通过检查图像的直方图(图中的像素的数目与像素强度值)。一幅好的图像其像素的强度会分布在最低和最高的像素值之间，而不是集中在最低端或最高端(即没有饱和或截断像素强度现象)。

4共聚焦显微镜样品的制备

共聚焦显微镜是可以用来采集各种不同荧光标记的样品图像的， 所以每台共聚焦显微镜是由各种不同的物镜和激光波长组合而成。这些都是在样品标记之前需要知道的共聚焦显微镜的重要参数，很少有博士生或博士后可以指定一个仪器的规格。因此，在样品标记之前，最重要的是要知道可用的共聚焦显微镜激光波长，这决定了可用于标记样品染色的荧光染料。表1提供了一个常见的共聚焦显微镜激光波长及其可以激发的一些常见的荧光染料。另外一个要考虑的因素是实验的要求以及光稳定性。一般来说，多色标记荧光染料应该有不同的激发和发射波长并且有高的光稳定性。大多数现代染料(如Cyanine, Alexa染料系列)比以前的(如FITC)更明亮、更稳定。

表1常见的激光共聚焦显微镜激光激发波长和可以激发的常见荧光染料

Table 1Common CLSM laser lines and the fluorophores which the laser line could be used to excite the dyes

激光波长/nmLaserwavelength/nm常见荧光标记物Commonfluorescentlabels405BFP,DAPI,Hoechst,Alexa405440CFP,Cerulean480EGFP,Alexa488,FITC514YFP,Rhodamine561DsRed,Tritc,Cy3;Alexa568594Texasred,mCherry,mRFP,633Cy5,Alexa647

“垃圾进，垃圾出”，这在任何生物学实验中都一样，对共聚焦显微镜更是如此，共聚焦显微镜对其样品的质量要求尤其严格。首先，共聚焦显微镜的样品必须做荧光标记，像其他任何生物学实验一样，样品标记也需要做一些基本的对照实验，比如对使用的抗体试剂的抗原验证，标记浓度的优化和对照实验都必须在共聚焦显微镜观察之前进行；此外，由于共聚焦显微镜采用针孔成像，图像质量尤其容易受其制样质量的影响，样品不但应该有高信噪比的标记，更重要的是使用与显微镜物镜设计匹配的折射率的包埋物和使用适当厚度的盖玻片。大多数显微镜物镜设计的光学矫正盖玻片是1.5 号盖玻片，其厚度是0.17 mm，盖玻片厚度对干镜和浸泡物镜尤其重要。包埋介质是显微镜的光学通路的一部分，在图像形成中起着关键的作用。表2给出了一些常用的包埋介质及其光学特性，用户可以根据实验选择合适的一种。 一般而言，硬化的包埋介质方便并可以长期储存(几星期至数月)，但由于其单体的聚合过程，经常会有明显的样品萎缩，这对三维重建会有负面影响。以甘油为基础的包埋介质是暂时的，但它常常提可以通常可以提供更好的三维形态。一种光学特性比较好的包埋介质是2,2’-硫基二乙醇(2,2’-Thiodiethanol)。它不需要脱水并且是一种非常有效的防褪色剂也与浸油折射率匹配。然而它不是永久性的，而且它不与DIC或相差显微技术兼容。在大多数情况下，在包埋介质中还要加一些防褪色剂。 商业产品包埋介质如 FluoraGold或Vectorsheild已经包含一些防褪色剂。如果实验室自己做配制包埋介质，需要加一些防褪色剂。表3列出了一些常见的防褪色剂及其使用浓度。

表2　共聚焦显微镜样品制备常用的样品包埋介质及其光学特性

注： PVA，Prolong Gold， DPX， Permount 都可以固化。

Note：PVA，Prolong Gold， DPX， Permount can be solidified.

表3　荧光显微镜 样品包埋常见的防褪色剂及其使用浓度

5激光共聚焦显微镜的成像设置

任何共聚焦显微镜，包括不同的品牌的仪器或配置，基本的工作流程如下：

5.1　定位样品-选择合适的物镜以及定位感兴趣的区域

共聚焦显微镜是一个取样的过程。比如，典型密度的培养的哺乳动物细胞，在一张22 mm×22 mm的盖玻片上大概有25~100万个细胞。激光共聚焦显微镜图像采集仅获得这些细胞中的几十到几百个有代表性细胞的图像。如果要得到有代表性的图像，最重要的是要做先期观察，在使用激光共聚焦显微镜前花一些时间在荧光显微镜下观察标本，这比共聚焦显微镜观察要快得多。

大多数的显微镜使用者都知道他们需要观察他们的样本的放大倍数。然而，很少有人问及物镜的数值孔径(NA)是什么。事实上数值孔径是考虑共聚焦显微镜成像的最重要的因素，该参数定义了透镜的光收集能力 (信号强度)，它也是确定图像分辨率的一个最重要的参数。显微镜的分辨率被定义为d= 0.61×λ/NA，其公式中是没有放大倍数这个因子的。共聚焦显微镜是一个扫描仪器，其缩放因子确定扫描区域和最终放大倍数。

在物镜的选择上，只要有可能，选择最高的数值孔径的物镜，而且保证该物镜的视野大小允许观察样本的感兴趣区域。用另外一个方式讲， 样品的大小决定了物镜的放大倍数。一般而言，物镜的放大倍数越高视野越小。共聚焦显微镜应选择最高的NA物镜。 这不仅使采集的图像的高分辨率更高， 也会因为镜头收集光量的增加使图像有更好的信噪比。 这是因为物镜采集的信号强度与数值孔径的平方成正比的：

信号强度I∝NA4/MAG2

对于微弱荧光染色，提高信号强度的最有效的方法是使用一个高数值孔径的物镜。

5.2　设置扫描系统参数

5.2.1滤光片配置

共聚焦激光扫描显微镜一般用来处理不同的成像要求以及尽可能多的荧光染料样品的组合。因此，使用激光共聚焦显微镜成像的第一步是建立对特定样品染料组合的扫描系统的配置。幸运的是，这通常是最不令人担忧的一步，因为大多数生产厂商或核心设施操作员已经建立了类似的应用程序库，需要使用的时候把相应的配置调出来就可以了。如果不清楚应该使用哪个设置， 请询求仪器操作员的帮助。这些设置通常需要对仪器以及荧光显微镜技术有更深层次的了解，超出了本文讨论范围。此外，还有一些关于多颜色样品的图像采集的特殊的注意事项，我们将在稍后(第7部分)讨论。

5.2.2针孔孔径大小和扫描速度的设置

激光共聚焦显微镜使用针孔阻断聚焦平面以外的光，所以设置的第一个因素是针孔孔径的大小。这通常是设置为1 Airy 单位，一般情况下1 Airy 单位适用于大多数的激光共聚焦显微镜的成像状况，仅在一些特殊情况下需要调整针孔孔径的大小。针孔的大小不仅仅影响一个共聚焦显微镜光学切片的厚度，而且还对检测器的信号的强度有非常大的影响[5]，尤其在样品折射率不匹配的情况下，需要调节针孔孔径来补偿因为球面像差而引起的信号衰减。比如用一个40X/NA 1.3的油镜聚焦到10 μm深的活细胞的水溶液样品中，共聚焦显微镜针孔的能量水平(即图像整体亮度)会下降到50%。在这样的情况下，针孔可以被设置为大于1 Airy单位，用以补偿因为折射率不匹配而引起的信号衰减。另外，当样品荧光信号太弱或者漂白现象过于严重的情况下，也可以调节针孔孔径的大小来增加信号强度。

共聚焦显微镜是一部点式扫描仪器，扫描速度决定了每个像素的积分时间，缩短单个像素的停留时间会导致减少每个像素成像的光子数。通常，扫描速度设置为单个像素的停留时间1~2 μs。 更慢的扫描速度将不仅仅增加图像采集需要的时间，而且会加重光漂白现象。

5.3　图像空间分辨率的设置

共聚焦显微镜的图像最终的空间分辨率通常是由图像幅的大小(图像的像素数)和缩放因子的大小(扫描的区域)两个设置决定的，这两个参数是彼此相关的， 增加像素的数目和(或)减少的扫描区域将会增加共聚焦显微镜图像的最终分辨率。然而，分辨率的增加是有限制的，超过一定的分辨率，增加更多的像素或缩小更小的扫描区域将不会再提高分辨率，这是因为光学显微镜分辨率是有限的。超越某个临界点的缩放因子会产生一种称为空放大的情况。在这种情况下，除了需要更多的时间来获取图像之外，荧光显微镜的光漂白现象会严重得多。这是因为光漂白速率是与缩放因子的平方成正比的：

光漂白速率=R∝k(缩放因子)2

因此，在共聚焦显微镜空间分辨率的设置中关键的目标是要捕获到显微镜可以提供的最高分辨率并且同时没有达到空放大状态。这个设置对共区域化分析这样的实验尤其重要，这是因为其分析结果在很大程度上取决于图像的分辨率(见第6部分)。大多数的现代共聚焦显微镜会自动提供一个最佳的像素大小的值(即每个像素所代表样品的空间大小的最佳尺寸)。这个值通常是根据显微镜的理论分辨率，用Nyquist-Shannon采样率计算而来。为了保持图像的信息内容，Nyquist-Shannon采样定率要求图像数字化后像素的尺寸(即每个像素所代表样品的空间大小)至少小于光学系统的分辨率极限的2.3倍。比如，用一个20X/NA 0.8物镜收集一个用Alexa 488染料标记的样品，扫描系统使用的收集发射波长为505 nm长通滤光片。该仪器的理论分辨率可以根据Abbe定律计算：

d=0.61×505 nm/0.8=385 nm

使用Nyquist-Shannon因子2.5(请注意Nyquist初始值为2.3，但是这个值可以延伸到3。通常，一个2.5的值是比较实用和适合于成像的)，每个像素的最佳值为：

d像素=385 nm/2.5=154 nm

最后的像素尺寸应该通过调整缩放因子和图像幅的大小(图像的像素数)达到这个值，该值确保了图像的最高的分辨率，但是尚未达到空放大状态，具体的设置方式取决于样本和实验要求。通常最终图像发表出版印刷时，一幅1 024*1 024的图像以300 dpi的图像被打印出来大体在半页左右。所以一般图像像幅不应该低于1 024*1 024。有些人喜欢使用固定的图像像幅大小而改变缩放因子大小来调节，以达到最终Nyquist-Shannon采样率。而其他人(主要是组织研究成像领域)更喜欢先设置扫描区域大小(即缩放因子)，后使用增加或减少像素数来调整到Nyquist-Shannon采样率。对于三维重组成像，共聚焦显微镜图像需要不仅仅在XY 平面, 而且需要在Z轴以Nyquist-Shannon采样率采样的： 即轴向的像素尺寸应该是轴向分辨率除以2.5。

5.4　图像对比度和亮度的设置

空间分辨率设置完成后，图像的对比度和亮度需要根据样品的染色情况调整。 这取决于：(1)染色的强度；(2)激光激发强度；(3)检测器的灵敏度(在大多数情况下是光电倍增管(Photo multiplier tube, PMT)；(4)系统的放大系数。最终的目标是数字文件图像应该具有完整的动态范围， 没有饱和像素或被截止的信号。通常激光共聚焦显微镜会用一种特殊的查找表(LUT，有时称为范位指示器(range indicator)或发光规模指示器(glowing scale) )把极端强度的像素用假彩色(peudocolors)显示出来(如红色显示饱和像素，蓝色显示值为0的像素)，像素的极端值之间的像素用灰度显示。仪器使用者应该询问仪器操作员或厂家如何把图像显示用这个特殊的查找表显示出来以方便调整图像的对比度和亮度，因为这是调节图像的两个重要参数的唯一可靠的方法。一般共聚焦显微镜的显示器并没有被校准过。而且人视觉感受敏感度是会因为环境照明条件和使用彩色而变化的，所以不能根据操作员的感觉来调整图像的对比度。

在以下描述的对图像对比度亮度调节的一般指导方法里，荧光探测器需要一些初始和定期的性能评估。一般而言，共聚焦显微镜的操作人员应该已经为每个荧光探测器测绘了一幅噪声水平与所施加的检测器电压的相关图 (通常是在探测器无光条件下所得到的图像的标准偏差)。这幅图会估计该探测器在不同电压下的噪声水平。更重要的是，这会给使用者一个PMT电压的有效使用范围，电压太高会使图像中的噪声超标，太低则可能使用了不必要高的激发光光量。

设置图像对比度和亮度的一般准则：(1) 改变图像显示查找表(LUT)为范围指示器(或有时称为发光规模指示器)。(2) 设置系统放大增益为1(有的系统没有这个设置)和调整增益/PMT电压有少量的饱和像素。如果增益太高(在图像中的扩噪音太大)，则做以下的一个或其组合：①增加系统放大增益和降低PMT电压到合理的水平(在有用的范围内); ②如果允许的话，打开针孔孔径(即使扩展到2到3个Airy单位也能得到合理的共聚焦图像); ③调整(增加)激光强度。但是染料饱和点(大部分染料分子被招募到发射荧光的激发光强度)决定了荧光信号的上限。在超过一定范围的激光强度的增加只会增加荧光标记物的漂白速度。这时激光强度的增加并不能增加信号的强度，但是会使荧光标记物的漂白发生得更快。如果增益太低(非常低的PMT电压， 一般PMT低于500 V)或如果发生过度漂白现象，则降低激光强度和调整(增加)PMT电压。 (3)调整图像的亮度。在图像中有几个黑色像素 (像素值为零)。(4) 检查直方图的最终图像的结果，以确保没有饱和或切断像素值。如果需要的话，微调增益设置。(5) 如果样本是多颜色标记， 对每个色彩重复(1)~(4)步。

5.5　图像的优化

如果图像对比度和亮度是按如上所述部分设置的话，则大多数情况下不需要任何图像优化步骤。然而通常一个典型的共聚焦显微镜图像包含大量的噪声，这是由于在衍射极限斑点内的光子强度是有限的，而且共聚焦显微镜采用光电倍增管作为探测器，过度放大情况下光电倍增管自己会产生大量噪声，当时间分辨率允许的时候，平均是最有效的减噪方法，这是以牺牲获取图像的时间为代价的。此外，增加激光的功率或打开针孔孔径也可以提高探测器的光信号水平，从而获得一个更好的信噪比图像。图2显示了平均对图像的影响。

图2　激光共聚焦显微镜成像的平均的效果体外培养的HeLa细胞核DAPI的标记Fig.2　Effect of averaging. Cultured Hela cells labelled with DAPI and imaged with a CLSM.　　注：图像的上半部平均16次可以观察到一些核结构的细节;而下半部没有平均的成像的区域因为检测器的噪声完全观察不到核染色的细节。Zeiss LSM710激光共聚焦显微镜， 63X/1.4油镜， 刻度条10 μm。Note:The top half of the image was averaged 16X time where some nuclear structure details are visible while the bottom half was imaged without averaging. Noises from the detector totally abolished the staining details. Scale bar 10 μm.

5.6　获取并保存图像

激光共聚焦显微镜所有参数设置好后，扫描图像，待扫描结束后将获得的图像保存于电脑中。

6多彩色荧光显微镜成像问题

多色荧光成像在激光共聚焦显微镜设置每个颜色通道的总的指导思想是和单色成像一样，多色荧光成像有其自身的问题值得讨论：第一个问题是荧光分子的光谱重叠的问题，大多数荧光物质具有广谱性，即其激发和发射光谱分布在几十甚至上百纳米范围内。这些包括交叉激发以及发射重叠两方面的问题。通过顺序扫描(如获得单独的颜色的图像后再扫描另外一个荧光信号)，可以有效地消除发射波谱重叠问题。但另一方面，交叉激发在激光共聚焦显微镜非常普遍， 这是由共聚焦显微镜使用强大的激发光和荧光分子的相对较宽的激发光谱造成的，只能用单独标记的样品对照样品来监测以确保没有发生这种情况，尤其在共区域化分析中特别重要。

另一个多色彩共区域化分析的题是色差，色差是物镜对不同波长的光聚焦不在同一点上。所以第一需要了解所使用的物镜的特性， 不是所有的物镜对所有的波长都做色差校正的。 第二， 即使物镜对所使用的波长做了色差校正，由于样品的折射率不匹配所造成的球面像差也会引起色差。一些共聚焦显微镜配备准直器允许某些波长在轴向的移动，色差对共区域化分析实验非常重要，确保共区域信号是真正来自同一结构，这可以通过使用低于光学分辨率的多彩珠子(0.1~0.2 μm)并观察其三维图像来验证。如果有色差，可以通过调节准直器消除或者消除色差因素(如调节包埋介质折射率或使用适当厚度的盖玻片)或在共区域化分析之前对图像使用适当的软件进行前期处理。

7激光共聚焦显微镜的扩展应用

提供一些常见的激光共聚焦显微镜扩展技术应用例子。大多数着重于共聚焦显微镜图像采集方面的讨论。

7.1　多色彩共区域化分析

多色彩共区域化分析是共聚焦显微镜最常见的应用， 将检测到的两个或更多的信号定位在相同的像素或体素(三维)，共聚焦显微镜图像特别适合做这样的分析，因为其图像的高清晰度提供了进行这种分析的基础。 对这种分析最关键是高分辨率的图像采集和系统性能的监测(例如色差误差)。多色彩共区域化分析有许多发表的算法[6,7]。此外，这种分析中的共聚焦显微镜图像采集的另一个最重要因素是噪声，提高标记的信噪比和使用更多的平均可以有效地减少噪声。图像的空间分辨率应在XY和Z轴方向都遵循Nyquist-Shannon采样率。

7.2　三维重组

激光共聚焦显微镜不仅可以获得多彩色的2维图像，也可以实现对较厚 (>10 μm)生物样品的快速三维重建。这是共聚焦显微镜最主要的技术优势。但是如果样品厚度仅几微米，使用激光共聚焦显微镜没有明显的优势。在这种情况下，一个宽领域的荧光显微镜将可以做类似的工作而且更经济。图3为一个果蝇幼虫大脑中5羟色胺神经元的共聚焦显微镜的三维重建。该样本总体厚度将近250 μm。 可以看到单个光学切片是不可能反映其神经结构的复杂性的。只有在三维重建之后才可以对其神经的总体概况有全面的了解。在正交图像中，可以观察其三维内部结构。

7.3　连续拍摄

使用绿色荧光蛋白标记(GFP)或其他活体荧光标记物的样本(例如钙活动指示剂等)，激光共聚焦显微镜可以连续拍摄图像。可以使用激光共聚焦显微镜来观察和研究生物活动。虽然共聚焦显微镜是工作过程相对比较缓慢，但是还是可以足够快对许多生物学事件进行观察。即使是单点扫描激光共聚焦显微镜，一些制造商将共振扫描仪结合在扫描光路，这项技术可以把激光共聚焦显微镜的扫描速度的提高到视频速率(每秒30帧)。此外，可以限制区域的扫描(甚至降低成像到一个单线扫描)，这允许激光共聚焦显微镜对更快的事件进行研究(时间分辨率可以达到毫秒范围内)。而且较新的仪器采用更灵敏的探测器，它允许使用更短的像素扫描时间来提高时间分辨率。 一般来说对激光共聚焦显微镜的活细胞成像，最重要的是减少光漂白导致的光毒性，可以使用最小的激光强度、最高灵敏度的探测器、降低缩放因子和减少平均等几个措施来减少光毒性。

图3　果蝇幼虫中枢神经系统抗5-羟色胺抗体标记的激光共聚焦显微镜成像(25X/NA 0.8, 油镜)Fig.3　A Drosophila larvae Central nervous system labelled with anti-serotonin antibody and imaged with a CLSM (25X/NA 0.8 multi immersion oil)　　注：一幅单一的激光共聚焦显微镜光学切片(A)演示了染色的细节。然而，标记的完整视图只体现在127幅激光共聚焦显微镜光学切片的最大强度投影重建( B)。 C正交切片相同的幼虫可以通过虚拟切片详细检查。Note:A single CLSM optical section (panel A) demonstrates staining details. However, the complete view of the labelling is only evident in the Maximum intensity projection reconstruction of 127xxx CLSM optical sections in Panel B. Panel C showing orthogonal sections of the same larvae where the labelling could be examined in detail by virtual sectioning. In this case, the structure could be viewed in 3 directions.

此外，还有更多的方式提高激光共聚焦显微镜技术的时间分辨率。其中的一种叫做旋转盘激光扫描共聚焦显微镜，它通过尼普科夫圆盘(Nipkow disk)将激光光束分为几千个小的光束。通过检测几千个共焦针孔的同时扫描和阵列探测器如CCD摄像头进行图像采集。因此，图像不是通过单点扫描，而是通过一个平行的扫描/检测系统得到一个更高的成像速度。高于视频速率(>30帧·秒-1)共聚焦可以通过这样的仪器实现。这类仪器的针孔孔径是固定的， 它往往是优化于某个数值孔径的物镜的。

7.4　分子间的相互作用和动力学的技术探讨

与基因编码的荧光探针如绿色荧光蛋白(GFP)结合，激光共聚焦显微镜可以很容易地用于活细胞生物动力学研究。其中一个方法就是所谓的FRAP(荧光漂白恢复)，用强激光束漂白了感兴趣的区域(ROI)。ROI恢复的速度可以提供许多关于荧光分子生物学意义的信息，如扩散系数、分子的区域化、结合与未结合的组分等。图4显示一个典型的FRAP实验， 在EGFP标记的组蛋白在方框内被漂白后，在连续摄影的续帧中显示出荧光分子的不同程度的恢复 (B，C)。 图E为ROI的恢复曲线，由此可以计算出半恢复时间。 FRAP技术可以用于做不同药物处理或可能影响分子的结合特性的分子基因突变的检测。

图4　典型的激光共聚焦显微镜FRAP(荧光漂白后恢复)实验——EGFP蛋白标记的HeLa细胞的组蛋白Fig.4　A typical FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) experiment using CLSM. A Hela cell nucleus labelled with EGFP histone.　　注：A对感兴趣要漂白的区域进行绘制(方块区域)和 强激光照射漂白(图B)导致ROI内荧光信号的消失。继续摄影监测(图C和D)漂白区域的荧光信号的恢复。 荧光恢复程度提供分子的流动性的信息。之后从荧光恢复曲线可以对图像做量化分析得到半恢复期时间(E)。Note:A Region of interest were draw (box in Panel A) and photobleached with strong laser illumination (Panel B) and notice the ROI are fluorescence signal disappeared. Continuing timelapse observations (panel C and D) of the recovery of the fluorescence in the ROI could provide mobility information of the molecules. Then a fluorescence recovery curve would be calculated from timelapse images. The recovery half-life (thalf) could be obtained.

虽然激光共聚焦显微镜是一个光学显微镜技术，其分辨率是一般大约是其使用光的波长的一半(Abbe定律)，最佳情况下只不过200 nm。然而激光共聚焦显微镜是可以用来检测分子间的相互作用的。 通过一种FRET的技术(荧光共振发射转移)，对荧光供体分子与受体分子通过偶极相互作用的测量， 可以测量供体分子与受体分子之间的距离，有许多种方法可以测量FRET信号强度。激光共聚焦显微镜可以很容易地实现受体漂白导致的供体荧光的恢复程度来测量FRET信号强度。此外， 虽然大多数的共聚焦显微镜采用连续波激光作为光源，有些可以用脉冲激光实现。在适当的硬件组合下，共聚焦显微镜可以测量荧光寿命。当FRET发生时，供体荧光分子寿命缩短。这种缩短是独立于荧光物质的浓度的。 因此荧光寿命的测量是一种更为可靠的FRET测量方法。

7.5　没有荧光标记样品的激光共聚焦显微镜成像

虽然共聚焦显微镜的设计主要是针对荧光标记的样品的，但该系统也可以通过反射式成像或样品的自发荧光来实现非荧光样品的成像。这尤其对植物样品或如昆虫一样具有外骨骼的样品有特殊的应用价值。

8结论

共聚焦显微镜无疑是许多荧光显微镜实验的首选工具。然而，对于系统的合理设置还需要一些显微镜的基本知识和对该技术的基本原理的理解才能更熟练高效地使用这项技术。该文总结了共聚焦显微镜图像采集的一些重要影响因素。总之，

图像采集要遵循Nyquist-Shannon采样率以得到最佳的图像空间分辨率。 而设置图像的对比度和

亮度需要用适当的LUT指标以确保适当的动态信息的获得。在此基础上我们进一步讨论了一些常见的先进荧光共焦显微镜的应用。

参考文献

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(编辑：马荣博)

Confocal laser scanning microscopy，a general guideline and its applications

Sun Xuejun1,2, Yan Xizhong1, Hao Chi1*

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu, 030801，China； 2.DepartmentofExp.Oncology,UniversityofAlberta,CrossCancerInstitute,Edmonton,T6G1Z2Canada)

Abstract:Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) is one of the most versatile fluorescence microscopy tools available in biological researches. Its popularity is mostly because of its remarkable optical sectioning and 3-Dimension (3-D) reconstruction capabilities. A CLSM could obtain sharp optical sections without out-of-focus blurs from a relatively thick biological specimen in a short period of time. A perfectly registered 3-D image stack from a CLSM allows extraordinary virtual visualization of the specimen. This technology review paper is intended for graduate students as well as young researchers to have some basic knowledge of the technology and intended to provide some guidelines for proficient usage of the equipment.

Key words:Fluorescence; Confocal; Microscopy; Imaging; 3-dimension reconstruction

中图分类号：TH742.64

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)01-0001-09

基金项目：山西省“百人计划”项目(201144)；山西省“131”领军人才项目；山西省自然科学基金(2015011072)；山西农业大学引进人才科研启动项目(2014ZZ08)

通讯作者：*郝赤，教授，博士生导师。Tel：0354-6287289； E-mail: chihao99@yahoo.com

作者简介：孙学俊(1963-)，男(汉)，山西大同人，研究员，博士，研究方向：细胞影像、神经生物学。

收稿日期：2015-11-03