APMP废水生物降解菌群的构建

李玉娇 刘 玉 陈洪雷

(齐鲁工业大学制浆造纸科学与技术教育部重点实验室,山东济南,250353)



·APMP废水处理·

APMP废水生物降解菌群的构建

李玉娇 刘 玉 陈洪雷

从APMP废水及好氧污泥中筛选出11株微生物菌株,并检测它们降解APMP废水中有机污染物的能力。结果显示,菌株W2、W4、W5、W7、S4、S5具有较强的有机污染物降解能力,其中,菌株S4的降解效果最佳,处理APMP废水120 h后,CODCr由6960 mg/L降至3351 mg/L,去除率达到51.9%。以这6株菌为出发菌株,结合统计学方法,采用6因素2水平的部分因子设计(FFD)实验,以最高CODCr去除率为响应值,考察单因素作用及多因素相互作用对废水降解的影响。结果表明,菌株W2、W4、W7、S4和S5是影响APMP废水有机污染物降解的主要因素,可用于构建针对APMP废水的优势降解菌群。

APMP废水；菌株筛选；COD；部分因子设计

(*E-mail: 13181724137@163.com)

碱性过氧化氢机械浆(APMP)废水主要来源于木片汽蒸、洗涤、化学预处理及浆料的洗涤、筛选、浓缩等处理过程。APMP废水中的COD和SS含量均较高,且颜色较深,毒性较大,对环境危害很大。制浆造纸废水的处理方法主要有物理法、化学法、物理化学法和生物法。由于生物法具有效率高、成本低、二次污染少等优点得到广泛的应用,废水的生物处理技术就是利用微生物的新陈代谢功能,使废水中呈溶解和胶体状态的有机污染物降解并转化为无害稳定的物质,从而使废水得以净化[1- 4]。目前对生物处理过程中高效菌种的研究也越来越多[5- 6],赵建[7]筛选出可用于造纸废水处理的抗性菌株,出水COD和色度都稳定在一个比较好的水平,科研人员[8-10]利用构建的优势降解菌群强化好氧颗粒污泥,提高制浆废水的降解效果,在厌氧处理的基础上,对原始好氧污泥处理后,废水CODCr由629 mg/L降至203 mg/L,废水色度由118 C.U.降至91 C.U.；而强化好氧污泥处理后,废水CODCr由629 mg/L降至146 mg/L,废水色度由118 C.U.降至72 C.U.。生物法处理制浆废水的关键是提高微生物对有机物的降解效率,筛选得到高效降解菌从而优化降解菌群。本研究将从污泥和APMP废水中提取出细菌,并筛选出高效菌株对其进行组合,找出降解效果最优的高效菌株的组合方式,达到高效处理APMP废水的目的。

1 实 验

1.1 原料

实验菌种：从好氧活性污泥和 APMP 废水中筛选菌株。

实验废水：杨木APMP综合废水,pH值为9.0,CODCr含量为6960 mg/L,BOD5含量为2920 mg/L。BOD5∶CODCr=0.42,大于0.3,可生化性较强。

1.2 培养基

无机盐溶液：KH2PO4420 mg/L,K2HPO4375 mg/L,(NH4)2SO4244 mg/L,NaCl 30 mg/L,CaCl230 mg/L,MgSO4·H2O 30 mg/L,FeCl3·6H2O 3 mg/L。

磷酸缓冲液(PBS)：NaCl 8 g/L,KCl 0.2 g/L,KH2PO40.2 g/L,K2HPO41.15 g/L。

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L。

LB固体培养基：在LB液体培养基中加入2%的琼脂粉。

以上试剂均在121℃条件下灭菌15 min。

图1 从不同介质中筛选出的菌落

1.3 菌株的筛选

无菌操作条件下,用移液枪分别从好氧污泥和APMP废水中取50 μL,转入10 mL、50 mL、100 mL无菌水中进行梯度稀释,将稀释后的废水涂布于3个分离平板上(LB固体培养基),30℃条件下静置培养36 h。

根据菌落生长的稀密程度,确定最佳稀释浓度的分离平板,再以菌落的形貌为特征,从分离平板上选取不同菌落,采用划线稀释法将单一菌落接种于新分离平板上,以进一步筛选纯菌株,放入细菌培养箱,30℃条件下静置培养36 h。将生长出来的菌落再次接种于斜面固体培养基中,静置培养36 h后,4℃保藏备用。

1.4 菌株的扩大培养及菌体收集

将分离的菌株分别接种于LB液体培养基中,30℃条件下振荡培养(150 r/min),待到对数生长期时,将包含菌体的培养液倒入150 mL经灭菌处理的离心管(121℃条件下灭菌20 min)中,5000 r/min条件下离心10 min,弃上清液,PBS缓冲液洗涤2次,收集菌体备用。

1.5 菌体形态的微观观察

无菌操作下取出目标菌体,-80℃条件下冷冻干燥8 h,喷金后利用扫描电子显微镜(SEM,JSM 5600 LV)观察各菌体的微观形态。

1.6 菌株生长曲线的测定

微生物悬浮液中的菌体对透过菌株悬浮液的光线具有吸收作用,在一定范围内,菌悬液中微生物的细胞浓度与透过的光密度成正比,因此可以利用该原理测量样品溶液中的光密度,以此来代表菌株的生长曲线。

将筛选出的菌株在30℃、140 r/min的条件下进行培养,在600 nm下采用紫外可见分光光度计测定菌液的光密度值(OD600)。初始加入菌株的OD600为0.2,每隔4 h检测其光密度值,当OD600不再增长时,停止检测。

1.7 APMP废水有机污染物的生物降解

分别取150 mL APMP废水至300 mL锥形瓶中,调节pH值为7.0，在121℃条件下灭菌20 min。将扩大培养后的菌株投加至废水中,使其在废水中的光密度值(OD600)为0.2,30℃下振荡培养(150 r/min),每隔6 h取水样5 mL检测其COD值,至COD值不再下降时结束实验。

1.8 废水的COD检测

采用重铬酸钾法进行测定。

1.9 优势菌群筛选实验设计

运用部分因子设计(FFD)优化,通过Minitab软件对部分因子及全因子设计数据进行回归分析。

2 结果与讨论

2.1 从废水和污泥中筛选降解菌

将APMP废水和活性污泥适当稀释后涂布于LB固体培养基中,放入30℃培养箱,静置培养36 h,观察菌株生长情况，如图1所示。由图1可知，平板上生长出不同的微生物菌落,它们在菌落色泽、质地、形状、表面粗糙度等形貌特征方面存在明显差异。将不同菌落采用划线稀释法重新接种于分离平板上,进一步纯化菌株。

对取自APMP废水和好氧活性污泥中的菌株进行筛选、分离,总共得到了11株的微生物菌体，其中6种来自APMP制浆废水(W1、W2、W3、W4、W5、W7),5种来自好氧活性污泥(S1、S3、S4、S5、S6)。

图2 各菌株的SEM图片

2.2 菌株个体微观形态的观察

扫描电镜能够观察到菌株的个体外观形态、长度、宽度等基本特征,从而能够更好地分析筛选出来的菌株。各菌株的基本特征见表1。

图2是从APMP废水和好氧活性污泥中筛选出来的菌株的SEM图片。由表1和图2可知,11种菌株的长度范围为1.5～7 μm,除W5、S3的宽度为0.5、2 μm以外,大部分菌株的宽度为1 μm左右,W1、S1的外观形态相同,都是长棒状,前后粗细均匀,其余的9种菌株在外观形态方面各不相同,因此可以断定筛选出的11种菌株属于不同的菌种。

表1 各菌株基本特征

2.3 菌株对APMP废水COD的去除效果

不同菌株对APMP废水COD的去除效果如表2所示。由表2可知，在筛选出的11株菌中,降解能力由大到小依次是：S4>W7>W2>S1>S6>S5>S3>W4>W3>W1>W5。其中,S4的降解效果最佳,处理120 h后,APMP废水CODCr由6960 mg/L降至3351 mg/L,去除率达到51.9%；菌株W7处理APMP废水120 h后,CODCr由6960 mg/L降至3445 mg/L,去除率达到50.5%,菌株W2的CODCr去除率也高达50%。

表2 不同菌株对APMP废水COD的去除效果

根据各菌株在不同时间段的吸光度可知,W3、S1、S3、S6基本没有生长,OD600在0.2左右徘徊,因此不适宜用作处理APMP废水的高效菌株,并且W5的生长状况良好,较W1有生长优势,再根据表2各菌株对废水的处理效果,筛选出W2、W4、W5、W7、S4、S5这6种高效降解菌。

图3为这6种菌株对APMP废水COD的去除情况。从图3可以看出，大多数菌落在第120 h左右时的去除效果最好,因为此时大多数菌落处于稳定期,增长速度很快,所以降解效果最好。总的来说,随着时间的增长CODCr是不断降低的,然后保持稳定或略有增长。因为在稳定期细菌的生长和死亡呈动态平衡,所以CODCr基本不变,略有增长的原因是因为细菌死亡的速度大于生长速度。

图3 各菌株对APMP废水COD的去除曲线图

2.4 菌株生长曲线

菌株在一种溶液中的生长发育状况可以通过菌株的生长曲线来了解,菌株的4个生长周期分别为隐晦期、对数生长期、稳定期和衰亡期,通过菌株生长曲线的测量,可以推测菌株在不同时间的生长状况。一般处理废水大都采用处于稳定期的菌株,这个时期菌株的数量和周围环境达到了一个动态平衡,能够平稳地降低废水中的污染物质,从而达到降低废水COD的目的。

图4 各菌株的生长曲线图

由图4各菌株的生长曲线图可知，W4、W5、W7、S4有着相似的生长规律,接种后的0～36 h为隐晦期,36～56 h为对数生长期,菌落开始快速增长,56～96 h为稳定期,细菌的生长和死亡呈动态平衡；S5、W2细菌的增长速度很快,接种后即开始增长,0～28 h为对数生长期,其后一直保持着稳定的增长速度,60～96 h为稳定期,细菌的生长和死亡呈动态平衡。

2.5 统计学方法构建APMP制浆废水优势降解菌群

以W2、W4、W5、W6、S3、S4 这 6 株菌作为分析因子,最高CODCr去除率(Rmax)为响应做6因素2水平的部分因子设计(FFD)实验,用于评估单株菌及混合菌对废水COD去除的影响,变量值如表3所示。

表3 部分因子设计实验编码值与实际值

6因素全因子分析需要64(26)组实验来评估主效应和交互效应,在本研究中,为减少工作量,选用部分因子分析设计,由16种实验构成的设计方案,在设计方案中,实验顺序随机排列,实验顺序详细信息及响应值Rmax见表4。

表4 实验设计和部分因子实验结果

图5为不同菌株或菌株联合对废水COD去除率的正态概率图。在图4中对响应即COD去除率有显著影响的因子离正态概率线较远,这些影响因子对COD降解有重要贡献；对响应没有显著影响的因子离正态概率线较近,这些较近的点的影响可以忽略不计。

因此从图5可以看出,单变量W4、S4和S5对废水COD的去除有重要意义。此外,在这个模型中有3种显著的交互作用,分别是X1X4、X1X2和X1X2X6。在这3种显著的交互作用中,X1X4和X1X2X6对Rmax产生积极的影响,而X1X2则有消极的影响。通过运用多元回归分析对实验数据进行分析并且忽略那些95%置信区间内不显著条件,从FFD中可以获得一个一价模型方程：

图5 不同菌株或菌株联合对废水CODCr去除率的正态概率图

Rmax=32.64+7.77X2+9.15X5+6.47X6+3.29X1X4- 4.11X1X2+3.31X1X2X6

从方程中可以看出,X1(W2)、X2(W4)、X4(W7)、X5(S4)和X6(S5)对APMP制浆废水COD的降解都有不同程度的影响,而X3(W5)对废水COD的降解没有显著影响。因此,可选出W2、W4、W7、S4和S5这5株菌构建APMP制浆废水的优势降解菌群。

3 结 论

3.1 利用稀释倍数法和划线稀释法,从APMP制浆废水和好氧污泥中共筛选纯化出11株菌株,根据各菌株在扫描电镜下的图片分析其基本特征,并结合COD去除效果和生长曲线图筛选出W2、W4、W5、W7、S4、S5这6种高效降解菌。其中S4的降解效果最佳,处理APMP废水120 h后,CODCr由6960 mg/L降至3351 mg/L,去除率达到51.9%；菌株W7处理APMP废水120 h后,CODCr由6960 mg/L降至3445 mg/L,去除率达到50.5%；菌株W2的去除率也高达50.0%。

3.2 以6株菌株为出发菌株用于降解APMP制浆废水中的有机污染物,先通过部分因子设计(FFD)实验,再运用多元回归分析,菌株W2、W4、W7、S4和S5是影响APMP废水降解有机污染物的主要因素,可用于构建针对APMP废水的优势降解菌群。

[1] ZHAO Yu-nan. Issues Related to the Pulp and Paper Wastewater Characteristics and Treatment[J]. China Pulp & Paper, 2010, 29(9): 41.

赵宇男. 制浆造纸废水特性及处理的相关问题[J]. 中国造纸, 2010, 29(9): 41.

[2] MIAO Qing-xian, QIN Meng-hua, HOU Qing-xi, et al. The Discussion of Treatment with High Yield Pulping Wastewater[J]. China Pulp & Paper, 2008, 27(1): 46.

苗庆显, 秦梦华, 侯庆喜, 等. 高得率制浆废水处理技术的探讨[J]. 中国造纸, 2008, 27(1): 46.

[3] Lan Huixia, Liu Xiaofeng, Chen Rui, et al. The research of EM bacteria enhanced activated sludge treating pulping middle-stage wastewater[J]. Paper Science & Technology, 2013, 32(1): 92.

蓝惠霞, 刘晓凤, 陈 睿, 等. EM菌增强活性污泥法处理制浆中段废水的研究[J]. 造纸科学与技术, 2013, 32(1)： 92.

[4] ZHANG Yong, CAO Chun-yu, FENG Wen-ying, et al. The Present Situation and the Development with Pollution of Pulping and Papermaking of Science and Technology in Our Country[J]. China Pulp & Paper, 2012, 31(2): 57.

张 勇, 曹春昱, 冯文英, 等. 我国制浆造纸污染治理科学技术的现状与发展[J]. 中国造纸, 2012, 31(2): 57.

[5] Wei Taoyuan, Zhang Suqin, Shao Linguang, et al. Isolation and characterization of acellulose-degrading bacteria[J]. Environmental Science & Technology, 2004, 27(5): 1.

魏桃员, 张素琴, 邵林广, 等. 一株纤维素降解细菌的分离及特性研究[J]. 环境科学与技术, 2004, 27(5): 1.

[6] Chen Yuancai, Lin Che-Jen, Gavin Jones, et al. Enhancing biodegradation of wastewater by microbial consortia with fractional factorial design[J] .Journal of Hazardous Materials, 2009, 171(1): 948.

[7] ZHAO Jian. Research can be used for papermaking wastewater treatment resistant strain selection and treatment effect[J]. Transactions of China Pulp and Paper, 2002, 17(2): 59.

赵 建. 可用于造纸废水处理的抗性菌株选育及处理效果的研究[J]. 中国造纸学报, 2002, 17(2): 59.

[8] SHI Ying-qiao, DING Lai-bao, Li Ping, et al. High Yield Pulp Efficient Biological Treatment of Wastewater-activated Sludge Process Sequence Poplar APMP Wastewater Pollution[J]. China Pulp & Paper, 2000, 19(3): 13.

施英乔, 丁来保, 李 萍, 等. 高得率浆废水的高效生化处理—序列活性污泥法处理低污染意杨APMP废水[J]. 中国造纸, 2000, 19(3): 13.

[9] SUN You-you, CHEN Yuan-cai, CHEN Hong-lei, et al. The Treatment of Immobilized Dominant Degradation Bacteria with Papermaking Wastewater[J]. China Pulp & Paper, 2011, 30(8): 39.

孙友友, 陈元彩, 陈洪雷, 等. 固定化优势降解菌群处理制浆造纸废水[J]. 中国造纸, 2011, 30(8): 39.

[10] Chen Honglei, Zhan Huaiyu, Chen Yuancai, et al. Improving the aerobic sludge treatment effect of pulping effluent of construction predominant flora[J]. Paper Science & Technology, 2012, 31(2): 83.

陈洪雷, 詹怀宇, 陈元彩, 等. 构建优势菌群提高好氧污泥对制浆废水的处理效果[J]. 造纸科学与技术, 2012, 31(2): 83.

The Construction of Micro Flora for Degrading APMP Effluent

LI Yu-jiao*LIU Yu CHEN Hong-lei

(KeyLabofPulpandPaperScience&TechnologyofMinistryofEducation,QiluUniversityofTechnology,Ji′nan,ShandongProvince, 250353)

APMP(Alkaline Peroxide Mechanical Pulp ) effluent belongs to high concentrated organic wastewater with high COD content and pollution load, its treatment is necessary for surrounding environment. By using the method of dilution multiple and crossed dilution the bacteria were screened from the aerobic sludge and APMP waste water. The wastewater COD removal efficiency of each bacterium was tested, with absorbance spectrophotometry curves and scanning electron microscope (SEM) images. Through part of the factorial design (FFD) experiment, using 6 factors at two levels experimental design, COD removal rate as response values, the results showed that the five strains of bacteria W2, W4, W7, S4 and S5 could be used to construct the microflora for APMP effluent degradation bacteria.

APMP effluent; strain screening; COD; fractional design

李玉娇女士,在读硕士研究生；研究方向：植物资源化学工程与木质纤维基功能材料。

(齐鲁工业大学制浆造纸科学与技术教育部重点实验室,山东济南,250353)

X793

A

10.11980/j.issn.0254- 508X.2016.01.007

2015- 08-16(修改稿)