HBV感染者胚胎中HBV DNA的测定及其相关因素分析

赵皖秋，任文娟，李伟，刘珊

(陕西省妇幼保健院生殖中心，西安　710003)



HBV感染者胚胎中HBV DNA的测定及其相关因素分析

赵皖秋，任文娟，李伟，刘珊*

(陕西省妇幼保健院生殖中心，西安710003)

【摘要】目的检测父/母为乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者的胚胎中是否存在HBV DNA，探讨HBV经配子垂直传播的可能性，同时评估影响垂直传播发生的相关因素。方法收集单方HBV感染的229对夫妻的310个废弃胚胎。采用套式聚合酶链反应(PCR)法测定胚胎样本中的HBV DNA。采用Logistic回归分析患者年龄、血清HBV DNA载量、血清HBV多种抗原或抗体存在情况及授精方法等因素与HBV DNA存在的相关性。结果7.74%(24/310)的胚胎中检出了HBV DNA；血清HBV DNA载量与胚胎中存在HBV DNA呈显著正相关[OR 4.128，95% CI(1.319，12.914)，P=0.015]；授精方式(IVF或ICSI)的差异对胚胎HBV DNA阳性检查率几乎无影响(P>0.05)；同一对夫妻的多个胚胎中只有部分胚胎存在HBV DNA。结论垂直传播可能是HBV重要的传播途径之一。对于HBV DNA高载量的父/母，自然受孕或助孕治疗前建议进行针对性治疗，以降低胚胎感染HBV的风险。

【关键词】乙型肝炎病毒；胚胎；垂直传播；HBV载量

(JReprodMed2016，25(1)：39-43)

乙型肝炎病毒(HBV)感染可导致急慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌。全球约20亿人感染HBV[1]，其中超过3.50亿人为慢性感染[2]。中国做为HBV感染高发地区，约60%的中国人有HBV感染史，9.8%的中国人为HBV慢性感染者[3]。HBV感染高发的一个重要原因是HBV可以垂直传播，估计超过30%的HBV感染是通过母婴垂直传播获得[4]。母婴垂直传播可分为产前传播、产时传播及产后传播。产前传播也称宫内传播，通常认为HBV突破胎盘屏障是造成胎儿宫内感染的最主要原因；产时传播主要是指胎儿在分娩过程中，由于宫缩而吞咽含有HBV的母体血液、羊水以及阴道分泌物等母体体液，或因为胎盘血管破裂，母血渗入胎儿血液中造成母婴垂直传播；产后传播即通过接触父母唾液、母乳喂养以及其他生活上的密切接触而造成的HBV感染。

传统观念认为，乙肝的垂直传播就是母婴垂直传播，但自Hadchouel等[5]研究发现HBV DNA可整合到精子基因组中后，越来越多的研究提示HBV可能经过精子垂直传播[6-12]。近期的研究则发现HBV DNA可整合入仓鼠卵母细胞基因组中[13]，HBV感染者不同发育阶段的卵母细胞均可检出乙肝核心抗原(HBcAg)和HBV DNA[14]，提示HBV感染可能经过生殖细胞(精子和卵母细胞)发生垂直传播。

目前，虽然有间接证据提示HBV可能通过感染生殖细胞进行垂直传播，但尚缺乏足够的直接证据支持。本研究通过检测父/母为HBV慢性感染者的废弃胚胎中是否存在HBV DNA，为HBV是否可通过生殖细胞传播提供直接证据，同时评估影响该垂直传播发生的相关因素。

材料与方法

一、主要设备与试剂

Applied Biosystems Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR仪购自美国Life Technologies公司；Bio-RAD PowerPac电泳仪购自美国伯乐公司；JS-680CR全自动凝胶成像分析仪购自上海培清科技有限公司；HBV DNA Detection试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

二、研究方法

1. 样本收集及处理：实验样本来源于2012年9月至2014年3月在我院辅助生殖中心行辅助生殖助孕治疗、单方HBV感染的229对不育夫妇的废弃胚胎(共310个)。本研究将乙肝表面抗原(HBsAg)阳性持续半年以上者认定为HBV感染。从单纯男方HBV感染的140对夫妇中获得废弃胚胎181个，从单纯女方HBV感染的89对夫妇中获得废弃胚胎129个。本研究经我院伦理委员会审议通过，并患者知情同意。

另外，选取同期在我院接受辅助生殖助孕治疗、未感染HBV的不育夫妇的废弃胚胎80例做为阴性对照。

本研究所纳入胚胎均为人工授精后培养72 h的废弃胚胎(异常受精或低于移植标准的胚胎)。经PBS清洗3次后，用毛细吸管将胚胎移入聚合酶链反应(PCR)管底，液氮冻存备用。

三、HBV DNA检测

使用HBV DNA Detection试剂盒检测胚胎中是否存在HBV DNA。采用套式PCR法特异性扩增乙肝病毒DNA中的S基因(基因序列第506~645)，S基因编码合成乙肝表面抗原的主蛋白，其与前S抗原共同组成乙肝表面抗原。因商品试剂盒PCR引物序列保密，故本文不能提供引物序列信息。首次PCR扩增的产物大小约510 bp，二次PCR扩增的产物大小约230 bp。以试剂盒提供的阳性模版做为阳性对照，其首次PCR扩增产物大小约603 bp，二次PCR扩增产物大小约350 bp。

套式PCR操作如下：向含有胚胎样本的PCR管中直接加入PCR反应液25 μl，振荡、离心后，按以下条件进行第1次扩增：94℃预变性1 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；再取2 μl第1次扩增产物做为模版，加入23 μl PCR反应液，按以下条件进行第2次扩增：94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，显示特异性扩增条带者视为HBV DNA阳性。

HBV DNA载量的测定，则按照临床常规，由我院临床检验科统一测定。

四、统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，分类变量比较采用卡方检验，相关性分析采用Logistic回归分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、PCR检测结果

单纯男方HBV感染的140对夫妻中13例(9.3%)检测到HBV DNA阳性胚胎，单纯女方HBV感染的89对夫妻中 11例(12.4%)检测到阳性结果(表1)。

在所检测的310例胚胎样本，检出HBV DNA阳性胚胎样本24个，检出率为7.74%。其中男方HBV感染者来源的181例胚胎中检出13例阳性，检出率为7.18%；女方HBV感染者来源的129例胚胎中检出11例，检出率为8.53%。经卡方检验，两者检出率无显著性差异(P>0.05)。

80例阴性对照胚胎未有阳性结果检出。

设立穿越高铁现场值班室和远程监控调度室，由侧穿高铁桥梁桩基工作小组统一指挥，进行24h监测、值班和巡视制度，确保盾构下穿铁路期间地表、洞内、值班室信息互通，出现问题第一时间处理。

二、胚胎HBV感染相关性因素分析

胚胎HBV感染相关性因素分析采用Logistic回归分析，入选因素包括：男/女方年龄、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBcAb-IgM、HBS1Ag、血清HBV DNA载量和授精方式[体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)]。

Logistic回归初始模型分析发现HBeAg阳性、HBeAb阳性和HBV DNA高载量(HBV DNA拷贝数>106/ml)与胚胎HBV感染具有显著相关性(P<0.05)。排除混杂因素后，Logistic回归分析发现仅HBV DNA高载量与胚胎HBV感染呈显著正相关[OR4.128，95%CI(1.319，12.914)，P=0.015](表2)。此外，单独对单纯男/女方为HBV感染者的样本采用卡方检验和Logistic回归分析发现：授精方式(IVF或ICSI)的差异对胚胎感染HBV的几率无显著影响(P>0.05)(表1)。

研究结果还发现：4对单纯男性HBV感染和5对单纯女性HBV感染夫妻同一批次多个胚胎中，仅有1个胚胎检出HBV DNA，并非所有受检胚胎HBV DNA均为阳性(表3)，提示源于同一对夫妻的多个胚胎中只有部分胚胎感染HBV。

表1单纯男/女HBV感染者不同授精方式与胚胎HBV感染的相关性

授精方式HBV感染者胚胎HBVDNA阳性检出率(%)单纯男方HBV感染单纯女方HBV感染IVF7.5(8/106)15.1(11/73)ICSI14.7(5/34)0(0/16)

注：卡方检验和Logistic回归分析P值均>0.05

表2各相关因素与胚胎HBV感染的相关性(Logistic回归分析，n=229)

相关因素数值OR值95%CIP值男方年龄(岁)31.0±4.40.9730.834-1.1360.732女方年龄(岁)29.9±4.00.9710.869-1.0850.602HBsAb阳性率(%)0(0/229)N/AN/AN/AHBeAg阳性率(%)28.8(66/229)0.9990.289-3.4470.998HBeAb阳性率(%)47.6(109/229)0.3530.093-1.3380.125HBcAb阳性率(%)100.0(229/229)N/AN/AN/AHBcAb-IgM阳性率(%)4.4(10/229)3.1560.314-31.6870.329HBS1Ag阳性率(%)62.4(143/229)1.2310.291-5.1990.778HBVDNA高载量比率(%)22.3(51/229)4.1281.319-12.9140.015*授精方式(IVF/ICSI)173/560.7950.282-2.2360.663

注：N/A：不适用；*P<0.05，呈显著正相关

表3同一对夫妻来源的多个胚胎HBV DNA检测结果

患者编号男方HBV感染女方HBV感染总检测胚胎数(个)HBVDNA阳性胚胎数(个)10-+4116+-2121+-2125-+5194-+21125-+21131+-21136+-21140-+31

讨论

Hadchouel等[5]研究首次发现HBV DNA可整合到精子基因组中，其他研究通过荧光原位杂交方法亦观察到HBV的基因序列整合到精子染色体上[6，9]。Ali等[7]从分化出1～2个细胞的胚胎中发现了HBV基因，而该胚胎来源于感染了HBV的人类精子与仓鼠去透明带卵母细胞的体外受精操作。以上研究提示HBV可能经精子垂直传播给胚胎。对女性HBV感染者的研究也发现，HBsAg、HBcAg和HBV DNA在不同发育阶段的卵细胞和卵巢组织中均可检出[14-15]，且HBV DNA可整合入仓鼠卵母细胞基因组中[13]，提示HBV也可能经卵细胞垂直传播。但是，目前对于HBV通过生殖细胞垂直传播的直接证据研究尚少。本研究结果显示，单纯男方HBV感染的140对夫妻中13例(9.3%)胚胎检测到阳性结果，单纯女方HBV感染的89对夫妻中 11例(12.4%)胚胎检测到阳性结果，在体外条件下的废弃胚胎中检测到HBV DNA，提示人类精子或卵细胞可能作为载体将HBV传播给胚胎。上述实验结果为“HBV经生殖细胞垂直传播”的假说提供了直接证据。

本研究还发现，源于同一对夫妻的同批次多个胚胎，只有部分胚胎检出HBV DNA，表明HBV对精子和卵母细胞的感染具有一定限制性，其具体机制尚需进一步的研究。其中不同卵母细胞感染HBV的差异性，可能与卵母细胞透明带的高度异构性有关[16]。此外，在本研究中，废弃胚胎中的HBV DNA需重复PCR后才能检测到，表明HBV DNA在感染胚胎中含量极低，提示HBV DNA在胚胎中不复制或仅极低水平的复制，其具体发生机制亦需要后续的深入研究来验证。

与模拟自然受精的IVF不同，ICSI是将精子通过显微注射注入卵母细胞，由于直接跨过了透明带的保护，外部HBV有可能直接进入胚胎，从而增加HBV感染的可能性，因此，欧洲许多国家反对为HBV感染者行ICSI[17]。目前，对于使用HBV感染者精液行ICSI后是否会增加胚胎HBV感染率尚存在争议，而对于单纯女性HBV感染者卵母细胞行ICSI后是否增加胚胎HBV感染率则尚无研究报道[17]。本研究结果显示，单纯男方HBV感染时，行ICSI助孕操作后胚胎HBV DNA的阳性率略高于行IVF的胚胎，但差异无统计学意义(P>0.05)；单纯女方为HBV感染时，行ICSI助孕操作后胚胎HBV DNA的阳性率低于行IVF的胚胎，但差异亦无统计学意义(P>0.05)。ICSI是否会显著增加胚胎感染HBV的几率，尚需更大样本的研究探讨。

已有研究报道母亲HBeAg阳性和高血清HBV DNA水平能增加HBV垂直传播的风险[18-22]，其中HBV宫内传播的风险与HBV DNA水平密切相关[23]，HBV DNA水平较HBeAg水平更能体现胎儿免疫预防HBV感染的失败率[22]。为确定经生殖细胞垂直感染HBV与HBeAg阳性、高血清HBV DNA水平等影响因素的相关性，本研究分析了男/女方年龄、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBclgM-Ab、HBS1Ag及血清HBV DNA载量等因素与胚胎HBV感染的相关性。经Logistic回归分析发现仅血清HBV DNA高载量与胚胎HBV感染呈显著性正相关，表明高浓度的HBV环境可显著增加胚胎HBV感染率，提示HBV感染者孕前应检测血清HBV DNA载量，对于高载量的患者应进行相应治疗，在降低HBV DNA载量后再怀孕，以降低胚胎感染HBV的可能性。

综上所述，无论男方或女方感染HBV，均可能出现胚胎HBV感染，提示经生殖细胞(精子和卵母细胞)垂直传播可能是HBV重要的传播途径之一。对于男方或女方感染HBV者，临床上进行ICSI或IVF辅助治疗前要进行综合评价，对于HBV DNA高载量的父/母，自然受孕或进行辅助生殖助孕治疗前均应进行针对性治疗，以降低胚胎感染HBV的风险。

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[编辑：肖晓辉]

Detection of HBV DNA in human embryos and analysis of risk factors of HBV vertical transmission

ZHAOWan-qiu，RENWen-juan，LIWei，LIUShan*

AssistedReproductionCenter，Maternal&ChildHealthCareHospitalofShaanxiProvince，Xi’an710003

【Abstract】

Objective： To detect whether hepatitis B virus (HBV) DNA exists in the embryos of the parents infected by HBV，and explore the passibility of HBV vertical transmission via the germ cell.

Methods： A total of 310 human embryos from 229 couples，in whom one of the spouses exhibited seropositive hepatitis B surface antigen (HBsAg)，were collected. HBV DNA in the embryos was detected by nested PCR. The correlation between the influence factors including patient age，serum HBV DNA load，serum HBV antigen/antibody level & insemination method and the presence of HBV DNA in embryos were evaluated by logistic regression analysis.

Results： HBV DNA was exhibited in 7.74% (24/310) of embryos. HBV DNA load in embryos were significantly positively correlated with the serum HBV DNA level (OR4.128，95%CI： 1.319-12.914，P=0.015). The insemination mode (IVF or ICSI) was not significantly related with HBV DNA positive rate in embryos (P>0.05). HBV DNA was only presented in part of embryos of the same parents with high serum HBV DNA level.

Conclusions： Vertical transmission is one of the important routes of HBV transmission. The targeted therapy should be recommended before natural conception or IVF treatment for the parents with high load of HBV DNA to reduce the risk of HBV infection to embryos.

Key words：Hepatitis B virus；Embryo；Vertical transmission；HBV DNA load

【作者简介】赵皖秋，男，陕西泾阳人，学士，主治医师，生殖医学专业.(*通讯作者，Email：123564787@qq.com)

【基金项目】陕西省妇幼保健院青年医生科研基金项目(Q201304)

【收稿日期】2015-04-25；【修回日期】2015-08-11

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.008