耳聋左慈丸对老年性耳聋模型小鼠血清SOD、MDA、PKC的影响※

张海静　王　哲　武　莹　张鹤

（辽宁中医药大学基础医学院病理教研室，沈阳　110847）



耳聋左慈丸对老年性耳聋模型小鼠血清SOD、MDA、PKC的影响※

张海静王哲*武莹张鹤

（辽宁中医药大学基础医学院病理教研室，沈阳110847）

摘要：目的研究耳聋左慈丸对老年性耳聋模型小鼠血清SOD、MDA、PKC含量的影响，探讨治疗老年性耳聋的机制。

方法将100只健康雄性SPF级昆明小鼠随机分为2组，对照组（CG）15只和造模组85只，造模组采用腹腔注射D-半乳糖（150 mg/kg.d），对照组腹腔注射等剂量0.9%生理盐水，每日1次，连续2个月。造模成功后，将75只小鼠随机分为5组，模型组（MG）、VitC组(VCG)、中药低剂量组(LDG)、中药中剂量组(MDG)、中药高剂量组(HDG)，每组15只。VCG灌胃VitC注射液（150 mg/kg.d），中药治疗组灌胃不同浓度耳聋左慈丸溶液，分别是LDG(0.3 g/ml)、MDG（0.6 g/ml)、HDG(1.2 g/ml），CG和MG灌胃等剂量的0.9%NaCl，每日1次，连续14天。采用听性脑干反应（ABR）检测听力水平，用比色法测定血清的SOD活性、MDA含量的变化，用双抗体夹心-酶联免疫吸附( ABC- ELISA)法检测血清中PKC的含量。结果与对照组相比，模型组小鼠的一般情况均减退，且各频率ABR值显著增高（P＜0.01或P＜0.05），血清SOD活性降低、血清MDA含量增高（P＜0.01）、血清PKC的含量升高(P＜0.01)。与模型组相比，中药组小鼠的一般情况均得到改善，且各频率ABR值降低（P＜0.01），依次是HDG＜MDG＜LDG，血清SOD活性升高，依次是HDG>MDG>LDG，血清MDA含量逐渐降低，依次是LDG>MDG>HDG，，减轻了氧自由基引起的病理损伤；VCG小鼠血清的SOD活性、MDA含量与LDG相近。中药各组显著降低血清PKC的含量(P＜0.01)。结论耳聋左慈丸可以减轻老年性耳聋模型小鼠的病理损害，对氧自由基的损伤有一定的保护作用；降低PKC浓度，从而对cAMP/PKC信号通路起调节作用。

关键词：耳聋左慈丸；SOD、MDA、PKC；老年性耳聋；实验研究；小鼠

耳聋左慈丸是治疗耳聋耳鸣的经典方，是在六味地黄丸的基础上增加了柴胡和磁石变更而来，临床观察和现代的实验研究均证实，耳聋左慈丸对药物性耳聋、突发性耳聋及老年性耳聋等均有确切的疗效，但具体的作用机制还不清楚，制约了耳聋左慈丸的临床应用发展[1]。老年性耳聋是一类伴随衰老而出现的听觉减退的疾病，它的发生与自由基损伤、线粒体DNA突变、微循环障碍、糖原蓄积以及细胞凋亡等有关[2]。大量研究[3]发现内耳氧化或抗氧化失衡在老年性耳聋过程中扮演了重要的角色。另外，有研究[4]证实了过氧化物阴离子在老年性耳蜗损害中的重要作用。正常生命活动中，机体会产生氧自由基维持能量代谢、清除机体内毒素、调节机体内多种信号传导通路等，发挥着重要的作用[5]。自由基的增加或减少都会对身体造成伤害，但机体内有抗氧化的系统来调节氧化与抗氧化的平衡。其中研究比较多的也是非常重要的酶就是超氧化物歧化酶（SOD）。研究发现[6]SOD对耳蜗神经元与耳蜗血管纹有重要的保护作用。有研究推测[7]PKC活化后可以减轻自由基对组织的损伤，从而对小鼠耳蜗产生保护作用。本实验通过对老年性耳聋模型小鼠SOD、MDA、PKC的检测，来探讨耳聋左慈丸对老年性耳聋模型小鼠的氧化保护作用，为进一步的实验研究提供依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物雄性清洁级昆明小鼠，4周龄，体质量（20±2）g，耳廓反射灵敏，共100只。由辽宁中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2主要药物与试剂耳聋左慈丸（兰州佛慈制药股份有限公司），维生素C注射液20 ml/2.5 g（辽宁中医药大学附属医院）；D-半乳糖；0.9%NaCl溶液，500 ml；10%戊巴比妥钠；冰醋酸；无水乙醇；SOD试剂盒（测总）、丙二醛（MDA），100T/96样，南京建成生物工程研究所。1.1.3主要仪器电子称，听觉生理工作站（Intelligent Hearing Systems），SMART ASSR OAE VRASmart EP&OAE听觉诱发电位-耳声发射记录系统：美国智听公司；分光光度计，低温高速离心机。

1.2方法

1.2.1分组将100只雄性昆明小鼠，常温常规安静状态下喂养，自由饮水，适应性喂养9天。按照随机数字表法随机分组，标记称重后，分为2组，对照组15只和造模组85只，将造模成功后的小鼠随机分为模型组、VitC组、高剂量组、中剂量组和低剂量组。

1.2.2造模根据相关参考文献，各组的给药方式和剂量如下：造模[8-11]采用腹腔注射D-半乳糖（150 mg/kg·d），每日1次，连续2个月。

1.2.3给药造模成功后，VCG组[12、13]灌胃VitC注射液（150 mg/kg·d），中药组[14-16]同时灌胃，每日1次，连续14天。空白对照组腹腔注射等剂量的0.9 %NaCl，每日1次，连续2个月后，灌胃等剂量的0.9 %NaCl。低、中、高剂量组按照人-鼠等效量[17、18]的1、2、4倍给药，分别是0.3 g/ml、0.6 g/ml、1.2 g/ml，每日1次，连续14天。根据耳聋左慈丸的使用说明书，可知每8丸相当于原生药3 g，根据所需浓度，在乳钵内研磨后，用生理盐水稀释到所需浓度用生理盐水溶解所需的丸药数。

1.3指标检测

1.3.1听力水平测定采用听性脑干反应（ABR）检测听力，在隔音屏蔽室内进行操作。用1 %戊巴比妥钠0.1 g/ kg麻醉后，将小鼠放在恒温电热毯上，温度控制在37°C左右。分别将金属电极的正极置于颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后皮下，接地电价置于对侧耳廓后皮下。应用听觉诱发点位-耳声发射记录系统给予短纯音（tone burst）刺激，依次为8 kHz、12 kHz和24 kHz，带通滤波100～1500 Hz，扫描时间为15 ms，强度从100 dB SPL开始，以5 dB逐次递减，阈值为至少重复出现两次的ABR波的强度。

1.3.2血清SOD活性、MDA、PKC含量的测定用摘除眼球取血法取血，静置离心后取血清，分别严格按照试剂盒说明书测定。

1.3.3统计学方法采用SPSS17.0软件包进行统计分析。计量资料采用（x±s），采用单因素方差分析，P＜0.01表示差异有非常显著性意义。

2　结果

2.1小鼠一般状况的观察造模过程中有小鼠死亡，死亡原因为雄性小鼠之间的撕咬，解决办法是换大的饲养笼。正常对照组的小鼠皮毛光亮，活动能力正常，体重增加，饮食水及大小便正常；模型组注射D-半乳糖后，随着时间的延长，小鼠逐渐表现出活动能力下降，脊椎隆起，体型消瘦，皮肤松弛，毛发稀疏，没有光泽，易脱落，易抓取，体重增加缓慢，精神萎靡，饮食减少，尿量增多。灌胃耳聋左慈丸后的各组，一般状况得到明显的改善。

2.2ABR检测结果在不同频率的刺激下，ABR阈值有明显的变化，与正常组相比，模型组的阈值均升高，有显著性差异（P＜0.01，表1），说明造模成功。灌胃后，在不同频率的刺激下，与模型组相比，ABR阈值有显著性差异（P＜0.01），随着耳聋左慈丸给药量的增加，ABR阈值逐渐降低，呈明显的效量关系（P＜0.01，表2），同一组不同频率的刺激对ABR的阈值影响没有统计学意义。

表1　造模后小鼠ABR阈值的变化　（x±s，dB SPL）

表2　小鼠12耳ABR阈值的比较　（x±s，dB SPL）

2.3小鼠血清SOD活性、MDA、PKC含量变化根据表3的实验结果，可知MG小鼠血清的SOD活性明显降低、MDA含量明显升高、PKC水平明显升高，均有统计学意义，提示造模成功。与MG相比，中药治疗组小鼠血清的SOD活性明显升高、MDA含量明显降低，其中SOD活性HDG>MDG>LDG，有统计学意义，MDA含量HDG＜MDG＜LDG，有统计学意义，而VCG与LDG组相近，没有统计学意义；HDG的小鼠血清PKC水平明显降低，有统计学意义，而MDG、LDG、VCG小鼠血清水平相近，没有统计学意义，提示没有量效关系。

表3　小鼠血清SOD活性、MDA含量、PKC水平　(x±s，n=8)

3　讨论

耳聋左慈丸是治疗老年性耳聋的经典方剂，在临床已有广泛的应用，但具体的作用机制尚不明确。目前研究老年性耳聋的发生与氧化损伤、基因缺失、糖原蓄积等有关[2]。根据所得的听力检测结果及小鼠的外在活动表现可知，采用D-半乳糖腹腔注射造模老年性耳聋是可行的，大量研究亦表明[9，19]，这是目前研究造模老年性耳聋比较稳定适合的方案，半乳糖摄入过量可使机体抗氧化能力下降，DNA氧化损伤加重，从而诱导内耳感觉细胞和中枢听觉神经细胞凋亡，并造成听力渐进性障碍。

耳蜗是有氧代谢非常旺盛的器官，在正常情况下，机体的氧化系统和抗氧化系统，处于平衡的状态，避免受到自由基的攻击。随着年龄的增加，机体的各方面的代谢减弱，氧化与抗氧化系统处于失衡的状态，自由基产生多于消除，耳蜗受到自由基的损害。在抗氧化酶系统中，超氧化物歧化酶SOD是重要的一员，其作用是清除体内代谢产生的氧自由基，产生大量氧自由基，易受到氧自由基和活性氧的攻击，SOD作为抗氧化剂对耳蜗有保护作用，因此他们提出SOD内耳基因治疗来抗氧化损伤[20]。有研究表明[21]，衰老与自由基引起的生物膜的脂类过氧化，导致膜结构损伤和功能失活有密切关系，且SOD活性随着年龄的增加而逐渐降低，而MDA随着年龄的增加而逐渐升高。自由基损害的体现之一就是MDA含量的增加，体内产生的自由基极易侵害细胞脂质中的不饱和脂肪酸而形成脂质自由基，从而引发脂质过氧化反应。过氧化脂质反应的产物丙二醛(MDA)又可通过蛋白质一级氨基基团反应与蛋白质交联，最终造成细胞功能的丧失和细胞体的破坏，故MDA可以作为判断氧化损伤的指标之一。本实验的研究结果可以看出，与模型组相比，耳聋左慈丸治疗组的小鼠听力改善，且血清的SOD活性提高、MDA的含量降低，提示了耳聋左慈丸治疗老年性耳聋的机制之一可能是抗自由基损伤。

蛋白激酶C（PKC）是磷脂酶依赖性的Ca2+激活的丝氨酸/苏氨酸激酶，是cAMP/PKC信号通路的关键酶，细胞在静止状态时PKC主要以非活性构象存在于胞浆中，当细胞受到丝裂原等刺激时，通过G蛋白活化磷脂酶C，使胞膜上肌醇脂酶活化并水解4，5-二磷酸脂酰肌醇产生三磷酸肌醇和甘油二脂(DG)，引起胞膜上DG瞬时间积累，DG则通过明显提高Ca2+的亲合力而活化PKC。活化的PKC在调节生物信号的传递，在调节细胞代谢、增殖分化与凋亡等方面均起到重要的作用。有研究表明[7]活化的PKC可以减轻自由基损伤，从而来减轻细胞的损伤和凋亡。本实验研究结果模型组小鼠血清的PKC的含量明显高于正常组，且有统计学意义。耳聋左慈丸各组的小鼠血清PKC含量降低，且有统计学意义，提示了耳聋左慈丸能够降低小鼠血清PKC的含量，起到了调节cAMP/PKC信号通路的作用，进一步提示了该信号通路可能在抗自由基损伤方面，与SOD等抗氧化酶有协同作用，具体耳聋左慈丸如何通过降低小鼠血清PKC的含量起抗自由基损伤的作用，从而达到改善老年性耳聋的病情，是否可能与该信号通路相关的其他因素有关，需要本课题组后续的实验研究。

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The Effect of Erlong Zuoci Pill on SOD, MDA and PKC in Serum of Mice with Presbycusis Model

ZHANG Haijing, WANG Zhe, WU Ying, ZHANG He
(Teaching and Research Section of Pathology, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China)

Abstract:Objective To research the effect of the Erlong Zuoci pill on SOD, MDA and PKC in serum of mice with presbycusis model and the related mechanism. Methods One hundred healthy male SPF Kunming mice were randomly divided into 2 groups: control group (CG) had fifteen mice, and molding group had eighty-five mice. The mice in CG were treated with 0.9% NaCl and the other mice were treated with ip D-galactose (150mg/kg.d) , once a day, with 2 months. After duplicating the mold, the seventy-five mice were randomly divided into 5 groups: model group (MG) , VitC group (VCG) , Chinese medicine low dose group (LDG) , Chinese medicine mid-dose group (MDG) , Chinese medicine high dose group (HDG) , with 15 mice ineach group. The mice in VCG were treated withVitC injection (150mg/kg.d) , the Chinese medicine group were treated with different density Erlong Zuoci pills, included LDG (0.3g/ml) , MDG (0.6g/ml) , HDG (1.2g/ml) once a day, with 14 days. We checked its listening ability by auditory brainstem response (ABR) , and used colorimetric method to determine the changes of the serum SOD activity and MDA content and the PKC in rats serum was detected by double antibody clip ELASA method. Results Compared with CG, the general condition of mice was subsided, the value of ABR in MG was increased markedly (P＜0.01 or P＜0.05) , the serum SOD activity decreased, and MDA content increased, PKC content increased (P＜0.01) . Compared with MG, the general condition of mice was improved, the value of ABR in the Chinese medicine group was decreased (P＜0.01 or P ＜0.05) , HDG ＜ MDG＜ LDG, the serum SOD activity was decreased, HDG >MDG > LDG, and MDA content1increased (P＜0.01) , LDG > MDG > HDG, and the SOD, MDA of LDG and VCG is similar. The PKC content of traditional medicine group were significantly decreased ( P＜0.01) . Conclusion The Erlong Zuoci pill can reduce the pathologic lesions of mice with presbycusis, protect from the damage caused by oxygen free radicals. The Erlong Zuoci pill could decrease PKC content and thus paly a regulatory role in the function of cAMP/PKC.

Keywords:Erlong Zuoci pill; SOD, MDA and PKC; presbycusis; experimental study; mice

收稿日期：（本文编辑：杨杰本文校对：王哲2015-10-13）

*通讯作者：wangzhe5655@163.com

基金项目：※辽宁省科学技术基金（No：2014020053）

doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2016.01.072

文章编号：1672-2779（2016）-01-0136-03