光遗传学手段研究脑功能的神经环路基础

段树民

·述评·

光遗传学手段研究脑功能的神经环路基础

段树民

段树民，男，1957年10月出生，安徽蒙城人，神经生物学家。2010年起任浙江大学医学部主任、医学院院长。1982年毕业于蚌埠医学院，1985年在南通医学院获硕士学位，1991年在日本九州大学获博士学位。

2000至2009年先后任中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员、神经科学国家重点实验室主任、副所长，2007年当选为中国科学院院士，2008年当选为第三世界科学院（TWAS）院士，2008年获何梁何利科学与技术进步奖，2010年起任浙江大学医学部主任、医学院院长。2010年获国家自然科学二等奖。第十一、十二届全国政协委员，中国神经科学会学会理事长，亚太神经科学学会主席。Neuroscience Bulletin主编，Journal Neurophysiology、Glia、Hippocampus、Neurobiology Disease和Cell Calcium等国际杂志编委。

长期从事神经生物学研究。在神经元-胶质细胞相互作用、突触发育和功能等研究领域做出系统的创新工作，在Science、Nature Cell Biology、Neuron等国际著名杂志发表系列研究论文，受到国际同行重视，促进了神经胶质细胞研究领域的发展。研究成果入选为2003年中国医药科技十大新闻，2006年中国基础研究十大新闻。

主要研究兴趣是突触形成和活动依赖性突触可塑性的机制，尤其对星形胶质细胞在突触形成和活动依赖性突触可塑性中的作用，并对胶质细胞释放活性物质的机理有深入研究。

脑功能；神经环路基础；神经网络

中枢神经系统损伤后很难修复，虽然这一领域的研究十分活跃，但真正取得的突破性进展还很少，仍需要各位专家的继续努力。本文主要从基础方面对脑功能的神经环路研究进行述评。

一、脑功能与脑区

脑功能和脑区的对应是神经科学界一直都很重视的问题。早在19世纪，一位叫Broca的医师发现了一个与语言有关的脑区，被称之为语言中枢，即Broca's区。进化论的观点认为，从猿到人类的进化最显著的一个特征就是语言的发展，推断人脑和猿脑最大的区别是语言中枢的发展。临床上发现失语患者的其他功能都正常，但其共同特征是左半球额下回后部Broca's区受损。

神经外科医生是最早对脑进行功能定位研究的先驱，其中最著名的是加拿大神经外科医生Penfield，他是神经基础学家Sherrington的学生。他在给患者进行手术时，为了最大程度地切除病灶并保证重要区域最小程度的损伤，他在手术过程中保持患者清醒，用电刺激病灶周围脑组织并观察患者反映，以确定不同脑区的功能。由于Penfield及其他研究者的贡献，先后有上百个脑功能区被确定，这些先辈的研究结果为现代解剖学教科书中脑功能定位提供了充分的科学试验依据。

另外一个著名的案例就是裂脑人。临床上通过切除胼胝体以控制对药物治疗无效的癫痫持续状态，患者术后癫痫得到有效控制，且并没有出现严重的副作用，日常生活和自主活动都正常。但是一位从事脑研究的科学家Sperry在给这些患者进行心理学和认知功能测试后发现了问题。当把术后患者的左眼蒙起来然后左手去操作，发现患者右眼看不到自己操作，且其动作和语言表达不一致。这一研究发现大脑两半球是有任务分工的[1]。虽然从解剖学来看这两半球是完全对称的且沟回结构都一致，但实际功能是有所不同。比如语言中枢、逻辑推理、数字计算等主要定位于左半球，而空间艺术、图像分析等功能主要定位于右半球。但即使我们基本知道大脑的区域功能，我们还是不能真正理解大脑是怎么工作的。

著名的分子生物学家克里克是DNA双螺旋结构的发现者，认为人类在解开DNA的生命密码以后，下一个最大的挑战就是解开大脑之谜。针对人的意识是怎样产生的问题，他提出了一系列的看法并在神经科学领域产生了重要的影响，比如认为意识或者灵魂应该是有物质基础的。如果我们能对大脑进行精细的解析，就能够从分子细胞水平来解释这些最重要的神经活动。这种观点其实也是神经科学家多年来努力的一个方向。最早从19世纪开始，西班牙科学家Cajal在对高尔基体进行染色时发现了脑内的一些神经细胞，然后根据它的染色、发育的不同状态进行分析，随后建立了神经元的学说。

二、神经元是脑功能的基本单元

脑功能的基本单元是神经元，而神经元的各部分各有其分工。比如感受短而粗的是树突，主要用来接收来自其它神经元的神经信号；还有一个细而长是轴突，其作用将神经信号传递给其它神经细胞。这些非常精辟的看法也都被后来的研究所证实，并且后来的研究对其功能进行了深入分析，使我们知道了神经细胞的信号是如何加工的。例如神经细胞信号的编码主要是通过电位发生的，电位的密度和方式就可能构成了该神经信息的编码。所以将来对某种脑功能进行解码时，可能需要通过神经电位活动的产生进行研究。

最重要的还是神经信息是如何传播的。信息从一个神经元传递到另外一个神经元，关键部位就是突触。突触是如何进行信息传递的，目前我们已经了解得比较清楚了，在这些研究中也造就了诸多诺贝尔奖获得者。总的来说，在微观上我们对脑组织已有了非常细致的了解。在宏观上我们在心理学的分析和系统神经功能的解析也建立了完整的学说，但是我们仍然无法解释大脑究竟是通过怎样的活动才会产生这些复杂的行为。我们虽然知道单个细胞怎么活动，单个突触怎么活动，但是其中最重要的一个关键点我们却无法对它进行研究，那就是神经环路。神经系统任何一个功能都依赖于大量的神经元构成的环路，并在环路状态下运转、工作，完成一个神经功能。但这样环路在过去是没有好的办法去进行研究。

对环路感兴趣的当然不仅是神经科学家，也包括人工智能领域的专家，他们把环路称之为神经网络。前不久计算机程序AlphaGo在围棋赛中战胜的新闻引起轰动，而在此之前多数人认为计算机是无法战胜人类的。我们知道如果计算机对围棋每一步的可能性都进行计算的话，这种可能性有10的170次方之多，这个数字超过整个宇宙原子的个数，而在目前的状况下计算机是无法对如此巨大的信息量进行计算的。那么AlphaGo是如何战胜人类的呢？就是因为它采用了神经网络的概念，而其中一个基础概念——可塑性，就是由神经科学家提出的[2]。

1949年，赫伯茨写过一本《行为组织学》的书，里面对神经科学的一些基本概念进行了理论的推导，例如神经网络是怎么形成的，记忆是怎么形成的。他认为，在神经发育的早期神经元之间网络的建立可能是随机的，一个神经元碰到另一个神经元就会建立一些联系，最后有些联系会被固定并强化，有些联系则会被弱化消除，其基本原则就是建立联系的两个神经元的活动一定要能够关联起来。以视觉举例，光对眼睛的刺激传到视觉皮层，视觉皮层就会对此产生反应，反复的关联活动就会让突触网络给固定下来；如果突触建立是错的，视觉传导传到其他地方，就没有正常的突触联系，这样后一级神经元就和前一级神经元没有关联活动，再经过一段时间突触活动就会退化，与用进废退和进化论的理论相似。这样的学说看上去比较简单，但其实是非常重要的，学习记忆也是这样。你给它一个反复刺激，它就会把这种神经信号给记录下来，也就是我们说的可塑性。

人工智能所用的概念其实很简单，把所有围棋大家的棋谱输入之后让机器人自己反复练习，成千上万次的练习之后它就会知道哪些步骤使用频率最高的，而频率高就说明是合理的，胜率也就比较大。所以在对围棋落子的可能性进行计算时，它不需要对所有的可能性进行计算，只要对那些可能性最大的步骤先计算就可以了。如果这个步骤不能赢，它会对下一个可能性进行计算，可想而知它计算的可能性不会需要太多就会找到胜利的途径。概念其实非常简单，但人脑就是无法跟它进行比试的，这是因为相对于人脑而言，机器人的计算能力是非常强大的。但是，虽然它战胜了人类，我们仍然认为它现在还处于弱人工智能阶段，和人脑是无法进行比较的。因为它的功能非常单一，无法做复杂环境下多功能的处理，如果达到人脑这样的状态就会进入到强人工智能。有人大胆推测如果人工智能发展迅速的话，可能不需要太长时间就会超过人脑，实现超人工智能。

三、神经网络的研究方法

神经网络和神经环路是脑功能的基础，但对其现象进行研究还是非常困难的，因为人脑实在太复杂。即使是果蝇的大脑，神经元数量和网络组织都是非常复杂的，要对这样复杂的网络进行解析，现阶段好像还是不可实现的。但问题总归要解决，之前提到的克里克认为我们无法对人脑的网络进行解析的主要原因是我们缺乏对脑细胞的操控[3]。神经网络非常复杂，它是多种类型的神经细胞所组成的，而目前我们对神经网络的了解，可能仅限于几十种或者一百多种神经元，随着分子生物学技术的不断地发展，会发现更多类型神经元，并且神经元的亚类会分得更细。可以想象，如果我们对网络里的每一个亚类进行功能分析操控的话，我们就有可能把整个网络的运作给解析出来。为此，克里克认为用电生理刺激可以精确调控上述网络[4]，然而，脑内神经细胞的电活动基础都是电压敏感性通道，电刺激会引起所有神经细胞的兴奋。他提出是否可以像刺激视网膜一样（视网膜细胞只对光敏感，对其它信号就不敏感），把光敏感的蛋白用遗传学的方法表达在我们想要研究的网络里面每一类的神经元上，我们就可以对这种神经元进行精确地调控，而光和电一样都可以非常快地进行毫秒级的刺激，这种毫秒级的刺激就可以形成一种编码行为。这种理念在20世纪70年代被科学家们提出，然而几十年的尝试一直都没有得到突破。由于视网膜对光敏感的蛋白是一个G蛋白偶联受体，它必须通过一系列第二信使复杂的转导系统转化成电信号才能让细胞的电活动发生改变，只转对光敏感的蛋白是不能够操控其它神经细胞的活动的。这种现象直到2003年才有所改变。德国的一位科学家从藻类克隆了一个对光敏感的离子通道[5]。它不是第二信使而是本身就是一个离子通道—阳离子通道，它只对光敏感性，这正好符合了克里克的理论。该离子通道发现以后，美国一位年轻科学家，很快就把离子通道用转基因的办法转到神经元，并证实转到神经元以后就可以用绿色的光控制神经元的活动，这个神经元的活动就像用电控制神经元活动一样，可以按人的要求发放动作电位。我们由此也知道，任何一类神经元都有它特殊的标记物，以此标记物作为驱动子就可以用转基因的办法将网络中的神经元转到光敏感的蛋白。比如说5-羟色胺类神经元，就可以用5-羟色胺或者5-羟色胺的关键酶作为驱动子，或者多巴胺能神经元可以用多巴胺作为驱动子。总的来说，在这种情况下，就能够在一个脑区里面对某一类神经元进行光操控，然后动物在清醒的状态下，拿一根光纤就可以对这个网络进行精确地操控并解析这个动物活动的规律。

四、光遗传学技术对神经环路的研究

下面介绍我们团队近几年应用光遗传学技术对神经环路工作进展。

首先介绍对胆碱能神经元应用光遗传学技术来研究它对睡眠和觉醒周期的转换调控机制。胆碱能系统是一个弥散性的觉醒系统，例如有一些人认为抽烟可以提神，这是可能一种广泛性的兴奋作用，而其精细的调控机制不清楚。睡眠有很多时相，不同时相里胆碱能系统能起到什么样的作用？大脑有很多觉醒系统，除了乙酰胆碱之外，还有去甲肾上腺素、5-羟色胺、多巴胺等很多种，这些不同的觉醒系统是否全部都一样，有何不同，或者是否有分工？这些在过去都是没办法做到的。乙酰胆碱在脑内虽然是广泛性的弥散投射，但是它在脑内主要分布有两个核团，一个是基底前脑，一个是脑干的核团，在这些核团里面含有的胆碱能神经元数目是非常少的。如基底前脑的胆碱能神经元只有5%，大部分神经元是谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）能神经元，所以对核团进行电生理或者其他的方法去操控的话是没办法精确操控到某单元系统的，那么就可以用这种方法去研究睡眠和觉醒。睡眠其实是比较容易研究的，它有非常好的刻板指标，脑电图、肌电图两个指标然后再观察行为，就能够得到非常精确的分析。

我们把对光敏感的通道蛋白表达在一单元的神经元上，鉴定后拿一根光纤进行试验，发现脑电图判断出动物在慢波睡眠时给他光刺激，蓝色光照亮后再刺激后可以看到它的脑电很快从慢波转化成快波，然后肌电就有活动，最后这个动物会清醒过来，这是非常快的一个转换。如果用药理学的方法可能就不会得到这么清晰的改变，这是慢波睡眠的情况。同样在睡觉的老鼠，如果是快波睡眠，脑电活动是增加的，肌电图是弱的，这时给它蓝光刺激后脑电和肌电基本上都没有变化，它不但没有醒过来甚至还会延长这种快波睡眠，这跟我们原来的想法完全相反。原来大家认为觉醒系统只要兴奋老鼠就会醒过来，现在基于非常精确地调控，我们就可以清楚地了解到这种现象。其他如去甲肾上腺素能神经元等研究时得出的结论则是，不管是快波睡眠还是慢波睡眠，它的激活都会让动物从睡眠状态到觉醒。这样的结果表明一些单元是有分工的，它主要是抑制慢波睡眠并产生了两种效应：一种让它醒过来；另一种它可能会转到快波睡眠，并且有一定的几率延长快波睡眠。还有一种有意思的现象，就是它有一个长时间的效应。例如老鼠都是白天睡觉晚上活动，如果在活跃期它本来就不睡觉，你给它刺激对它影响不大，还是处于一种觉醒状态；等到白天睡觉时它会很快觉醒过来，会产生一种类似失眠状态且持续比较长时间。我们认为是因为它有长时间效应，即觉醒状态刺激5分钟可以延迟几个小时甚至十几个小时，在它睡眠状态之后就会产生后续作用。这项研究的意义就在于让大家对失眠焦虑有了新的看法。过去认为对睡眠调节主要有两大因素：一是睡眠压力，如果人们长时间不睡觉就会产生睡眠压力，犯困睡觉；另外就是生物节律，人类白天活动晚上睡觉，如果去美国或欧洲出差时差倒不过来就会非常难受，就是睡眠节律在起作用。但出去这两项因素，现在认为还有一项因素会对睡眠产生影响，就是人的警醒水平。工作压力较大或有比较重要的事情时人会高度紧张，大脑就处于高度的兴奋状态，晚上该睡觉时总是静不下来，睡不着。这就是现在的第三种观点，警醒的水平也会对睡眠产生影响。我们研究发现的现象正好符合这种看法，就是大脑产生短暂的兴奋以后可以让大脑产生一个长时间的警醒水平，然后可能会对动物产生失眠甚至焦虑，这也可能是一种机制。

要介绍的第二个方面的内容就是用光遗传学方法来研究恐惧行为[6]。我们知道对生物来说，恐惧也是一项重要的功能，现在恐惧所引起的焦虑及抑郁症的发病率也较高。恐惧可以分成两类，一种是先天性恐惧，如老鼠怕猫，有些人怕蛇，有些人恐高，这些都是生来就有的。还有一种是条件性恐惧，是受到某种伤害刺激以后才产生的恐惧，一朝被蛇咬十年怕井绳就是这样的意思。条件性恐惧有很好的研究模型，给予动物电休克刺激并将光和声音联系在一起，一段时间后即使没有电休克，相应的电刺激或者声音刺激都会让它产生恐惧心理，因为它知道马上就会有伤害性刺激，对这种行为，环路基础行为研究相对比较清楚。但对于先天性恐惧的神经环路基础尚不清楚。我们对这种行为进行了一些研究，一个简单的方法就是用狐狸尿液的成分来刺激小鼠。因为狐狸吃老鼠，老鼠闻到气味就会害怕。用这种分子去刺激小鼠之后发现，不同脑区有C反应蛋白增高，表明脑的某些部位因气味引起兴奋，这些脑区有些是和嗅觉有关的，有些是和一般性的恐惧行为有关的。但是我们发现有个脑区是过去没注意的，就是脑桥被盖背外侧区。这是原来研究睡眠时曾经注意到的一个核团，也是一个乙酰胆碱能的核团，但是同样的是其中大部分神经元不是乙酰胆碱能神经元，是其他的神经元。进行分析发现，狐狸尿液的提取物所兴奋的并不是胆碱能神经元，而是GABA能神经元，是抑制性的神经元，这是一个非常意外的结果。我们知道要控制一种行为，总归是一类神经元兴奋以后然后产生行为，而这种气味它兴奋的则是抑制性的神经元，是让脑子的活动水平下降的，于是我们研究观察抑制性神经元兴奋以后是否会产生恐惧行为。在GABA能神经元转向通道进行光刺激后，动物马上停止不动，和老鼠见到猫趴在那里无法行动一样，光一旦停止动物就又开始活动了[7]。研究效果非常显著，90%以上的老鼠都有这种行为，但是此时脑电图和肌电图都是一种清醒状态，表明这并不是睡眠，也不是其它的行为。若不是兴奋GABA能神经元，而是反之将谷氨酸能神经元抑制掉，用光遗传学方法去操控不但可以兴奋神经元也可以抑制神经元，那么把谷氨酸能神经元抑制后也会产生同样的行为，就像兴奋GABA能神经元一样[8]。所以总的结论就是这个核团的主流神经元被抑制以后这个动物就会产生一种冻结（Freezing）行为。当然它并不是一种恐惧行为，如果是恐惧行为，除了Freezing以外还应该有其它的行为。现常用四个标准：逃跑、发抖、不动以及自主神经的活动，比如说交感神经的兴奋，激素的分泌，另外如果长时间地刺激就会产生一种焦虑行为。实验发现这些行为确实都有的，例如用GABA能受体的激动剂注入核团后，它会产生同样的Freezing行为；另外心律变快也是交感神经兴奋的表现之一，也就是恐惧行为的一种反应。如果对网络进行进一步解析还发现其他情况，例如GABA能神经元其实可以进一步细分不同亚型，在脑桥被盖背外侧区核团里可以分成生长激素抑制素(somatostatin，SST)类型和小白蛋白(parvalbumin，PV)类型两类亚类，研究发现兴奋这两种亚类的神经元所产生的行为是完全相反的。兴奋PV这类神经元，它产生的反应与兴奋整个GABA能神经元的行为是一致的，也会产生恐惧行为，但兴奋SST类型神经元后，并未引起恐惧行为。就是说同样的GABA能神经元，刺激不同亚型所产生的结果也是不一样的，有时不但不会引起恐惧行为，相反还会抑制恐惧行为的发生。例如兴奋SST神经元后，再给狐狸尿时老鼠就不会害怕，也不会产生Freezing反应，其作用是拮抗Freezing行为。研究表明在一个复杂环路中抑制性神经元的分布和联系是不同的，PV神经元作为主要的神经元是抑制主流神经元的活动，而SST神经元会反馈抑制PV神经元。这进一步说明，一个网络里面的活动其实不是简单的兴奋和抑制，它是一个复杂的神经网络活动。

[1]Sperry RW.Hemisphere deconnection and unity in conscious awareness[J].Am Psychol,1968,23(10):723-733.

[2]Eichmann A,Le Noble F,Autiero M,et al.Guidance of vascular and neural network formation[J].Curr Opin Neurobiol,2005,15 (1):108-115.

[3]Witt JC,Clark JW.Experiments in artificial psychology: conditioning of asynchronous neural network models[J].Math Biosci,1990,99(1):77-104.

[4]Clark JW.Neural network modelling[J].Phys Med Biol,1991,36 (10):1259-1317.

[5]Kateriya S,Nagel G,Bamberg E,et al."Vision"in single-celled algae[J].News Physiol Sci,2004,19:133-137.

[6]Cao ZF,Burdakov D,Sarnyai Z.Optogenetics:potentials for addiction research[J].Addict Biol,2011,16(4):519-531.

[7]Duebel J,Marazova K,Sahel JA.Optogenetics[J].Curr Opin Ophthalmol,2015,26(3):226-232.

[8]Fellippa-Marques S,Vinay L,Clarac F.Spontaneous and locomotor-related GAB Aergic input onto primary afferents in the neonatal rat[J].Eur J Neurosci,2000,12(1):155-164.

2016-03-12）

（本文编辑：张丽）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.04.001

310058杭州，浙江大学医学部

段树民，Email：duanshumin@zju.edu.cn

段树民.光遗传学手段研究脑功能的神经环路基础[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2016,2(4):193-197.