碱式法对板栗多糖提取的优化研究

张泽俊，汪武春，李 燕，马元铿，师 睿，陈祥刚

(1.昭通学院 化学与生命科学学院， 云南 昭通 657000； 2.昭通市昭阳区 北闸中学， 云南 昭通 657000)

●化学与环境资源研究

碱式法对板栗多糖提取的优化研究

张泽俊1，汪武春1，李 燕1，马元铿1，师 睿1，陈祥刚2

(1.昭通学院 化学与生命科学学院， 云南 昭通 657000； 2.昭通市昭阳区 北闸中学， 云南 昭通 657000)

以昭通市售板栗板栗粉为原料,采用碱提取法对板栗干粉中多糖进行提取.经sevage试剂除去蛋白质、乙醇沉淀、有机溶剂(无水乙醇、丙酮、石油醚)洗涤脱去脂肪后用蒽酮-硫酸溶液比色法测定其含量，通过单因素实验法在以固定的料液比(1∶40)、原料粒径(过80目分样筛)分别研究不同浓度、时间、温度条件下的最优提取参数.结果表明：最佳提取参数为：提取浓度0.5mol/l、提取时间90min、提取温度80℃，在最佳的提取参数下浸提一次的提取率高达26.47%.

板栗； 多糖； 碱式提取； 优化研究

1 引言

板栗(Castanea mollissima)，又名栗子、毛栗、风栗，是壳斗科栗属植物，原产于中国，分布极其广泛，栗子生命力强，易存活，雌雄同株，适应生长于海拔370—280 0m的地区，多见于山地，目前我国板栗已被命名的品种多达300余个，但主要可分为两大品种类型，即北方板栗和南方板栗，现已由人工大量栽培.其人工种植板栗多为野生板栗杂交培养后的改良品种，因个大、味甜、抗病性强，已成为山区农民主要农产品经济收入之.板栗属于坚果类，是我国的特产果品之一，其果实秋季成熟时采收，营养价值高，素有“干果之王”的美誉，与桃、杏、李、枣并称“五果”，国外称之为“健康食品”，民间常将其与枣、柿并称“铁杆庄稼”或“木本粮食”可代粮食用.对其营养成分进行分析测定后得知，其果实含水量高达40%左右，蛋白质含量为5.7%—10.7%，脂肪含量为2.0%—7.4%，淀粉含量高达50%左右，并含有多种维生素(如维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素C)和矿物质(如P、K、Ca、Fe、Zn等)[1].板栗不但具有较高的经济价值和营养价值，而且药用价值也很高，其性能自古以来便受到人们的重视，许多医学典籍中也多有论述.中医认为，板栗味甘、性温，有健脾胃、益气、补肾、壮腰、强筋、止血和消肿强心的功效，老少皆宜，适合于肾虚引起的腰膝酸软、腰腿不利、小便增多以及脾胃虚寒引起的慢性腹泻、外伤后引起的骨折、瘀血肿痛、筋骨疼痛、尿血、便血等症.板栗中所含的丰富不饱和脂肪酸和维生素，能防治高血压病、冠心病和动脉硬化等疾病是抗衰老、延年益寿的滋补佳品，堪与人参、黄芪、当归等名贵中药材相媲美且价格低廉，因此备受历代医家的推崇.唐代大医学家孙思邈称栗子为“肾之果也，肾病宜食之”.

多糖(polysaccharide)不是一种纯粹的化学物质，而是一类分子结构复杂聚合程度不同且庞大的糖类混合物质.是由糖苷键结合的糖链，多个组成的聚合糖高分子碳水化合物及其衍生物，可用通式(C6H10O5)n表示.由相同的单糖组成的多糖称为同多糖，也称均一性多糖.如淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖或不均一性多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成.多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，最终完全水解得到单糖.

多糖在自然界分布极广，亦很重要.近些年的研究发现，多糖不仅仅是机体储存能量的物质，而且具有一系列重要的生物学功能，在临床作用中有增强机体免疫力、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗衰老、抗辐射、抗疲劳、抗炎、镇痛、抗溃疡、预防急性肾衰、抗凝血等功效[2-3].如肽聚糖和纤维素，是构成动植物细胞壁的组成成分；糖原和淀粉是动植物储藏的养分；人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用；刘敏等从植物中获得一种具有良好的保湿、抗皱等作用的酸性杂多糖[4]；板栗是世界上多糖含量较高的果实之一，越来越受人们的关注，近年来国内外均有对板栗及板栗壳多糖提取工艺和相关生物性质的文献报道.如李润丰，刁华娟等[5]对板栗多糖的提取及抗氧化活性研究；杨利剑[6]板栗多糖的提取 、 成分分析及活性测定.目前我国对多糖的提取方面研究较为深入，主要采用方法有超声波辅助提取技术[7-10]热水浸提[11-13]酸提取[14-16]碱提取[17-19]酶解[20]微波提取[21-22]醇提取法[23]等本文采用碱提取法对板栗多糖的提取优化研究.

2 材料与方法

2.1 材料

原材料：板栗(昭通市售).

主要试剂：葡萄糖、氢氧化钠、活性炭、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、石油醚、蒽酮、浓硫酸、无水乙醇均为分析纯，去离子水.

主要仪器：80目分样筛、电热鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司)、HH-S型恒温水浴锅、高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)、电子天平、SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵、WFJ-7200型可见分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)、移液枪.

2.2 方法

2.2.1 板栗多糖的提取流程如下

板栗→剥壳去衣→烘干→粉碎过筛→提取→离心→脱色→过滤→浓缩→除蛋白质→乙醇沉淀→离心→洗涤→干燥

2.2.2 样品预处理

将市板栗剥壳去皮后置于电热鼓风干燥箱中50℃下烘干至恒重，粉碎过80目分样筛，装入密封袋备用.

2.2.3 板栗多糖的提取

参照文献[24]的方法准确称取经预处理后的板栗干粉1.000 0g，以1∶40的料液比(m/v)加入用去离子水精准配置好的，一定浓度的氢氧化钠溶液.按不同的氢氧化钠浓度、提取时间、提取温度为实验因素做单因素试验，进行多糖的提取.离心5min(6 000r/min)除去细渣，上清液加入活性炭脱色离心去渣，重复脱色3次，清液至于电热鼓风干燥箱中60℃浓缩至粘稠，移至分液漏斗中加入sevage试剂(三氯甲烷：正丁醇=4∶1，v/v)充分振荡摇匀后静置分层，弃去下层液，反复操作至无蛋白质即继续加入sevag试剂下层不在出现灰白色黏液为止.上清液加入2倍体积的无水乙醇，5℃沉淀过夜.离心5min(6 000r/min)除去清液，沉淀物分别用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤多次除去脂肪，电热鼓风干燥箱中65℃烘干称重.

2.3 多糖含量的测定参考文献[24-26]

2.3.1 标准溶液的配置

准确称取经干燥至恒重的葡萄糖0.250 0g，用去离子水溶解并移至250mL容量瓶中摇匀、定容、标定至刻度线，得萄糖标准溶液.用移液枪分别移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的标准溶液依次置于6支试管中，并编号，再分别加入去离子水稀释至10mL，摇匀备用.

2.3.2 标准曲线的绘制

图1 葡萄糖的标准曲线

分别移取1mL上述稀释后的葡萄糖标准溶液于试管中，编号，以1mL去离子水作为空白对照组，再向每支试管中加入4mL现配置的0.2%的蒽酮-硫酸溶液(0.200g蒽酮溶于100mL浓硫酸)，立即振荡摇匀，冷却至室温，置于沸水浴锅中反应5min后取出置于装有冷水的烧杯中冷却至室温，静置5min后，在620nm波长下分别测出其吸光度，记录数据，以葡萄糖的质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，做回归处理，绘制标准曲线如图1，并求出回归方程Y=0.006 0X+0.033 9(相关系数R2=0.991 1).

2.3.3 板栗多糖含量的测定

将提取所得的样品用去离子水溶解至1 000mL容量瓶中定容，用移液枪移取1mL于100mL容量瓶中定容，然后分别移取1mL与三支试管中做平行测定，以1mL去离子水做空白对照，分别加入4mL蒽酮-硫酸溶液，按标准曲线的测定方法测定样品溶液的吸光度，根据标准溶液的回归方程求出多糖含量.

2.3.4 板栗多糖提取率的计算

计算公式：提取率=m提取物/m原料×100%

2.4 碱式法提取板栗多糖的参数工艺优化

2.4.1 单因素试验

分别称取相同质量的板栗干粉，在固定的料液比(板栗干粉∶氢氧化钠溶液=1∶40，m/v)[20]，来研究不同浓度、提取时间、温度对碱式法提取板栗多糖效果的影响，从而研究板栗多糖提取条件的最佳优化.

2.4.2 不同的提取液浓度

准确称取1.000 0g经处理后的板栗干粉7份，在料液比为1∶40，提取温度为70℃，提取时间为90min的相同条件下，分别以不同浓度的氢氧化钠溶液(0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5mol/L)为变量，进行板栗多糖的一次性提取，按2.2.1中的优化流程操作完成，并计算提取率.

2.4.3 不同的提取时间

准确称取1.000 0g经处理后的板栗干粉4份，在料液比为1∶40，提取温度为70℃，2.4.2中提取率最高的氢氧化钠溶液浓度即1.5mol/L的相同条件下，分别以不同的提取时间(30min、60min、90min、120min)为变量进行板栗多糖的一次性提取，按2.2.1中的优化流程操作完成，并计算提取率.

2.4.4 不同的提取温度

准确称取1.000 0g经处理后的板栗干粉4份，在料液比为1∶40，1.4.1和2.4.3中提取率最高的提取时间90min、氢氧化钠溶液浓度1.5mol/L的相同条件下，分别以不同的提取温度(55℃、70℃、80℃、95℃)为变量进行板栗多糖的一次性提取，按2.2.1中的优化流程操作完成，并计算提取率.

3 结果与分析

3.1 不同提取液浓度对板栗多糖提取率的影响

由图2可以看出在氢氧化钠溶液浓度为0.5-1.0mol/L之间，多糖的提取率增长幅度较大，在1.5mol时出现峰值，之后大幅度降低，由此说明碱式法对板栗多糖的优化提取最适浓度参数为1.5mol/L.

图2 氢氧化钠溶液浓度对多糖提取率的影响

3.2 不同的提取时间对板栗多糖提取率的影响

由图3可以看出提取时间小于90min之间，多糖的提取率随着时间的增加而逐渐增大，在90min时提取率最大，之后逐渐降低，由此说明碱式法对板栗多糖的优化提取最适提取时间参数为90min.

图3 提取时间对多糖提取率的影响

3.3 不同的提取温度对板栗多糖提取率的影响

由图4可以看出提取温度在80℃之前，随着提取温度的不断升高多糖的提取率也随之增大，且在80℃时最大，之后随温度的升高而大幅度降低，由此说明碱式法对板栗多糖的优化提取最适提取温度参数为80℃.

图4 提取温度对多糖提取率的影响

4 结论与讨论

本实验采用碱提法对板栗多糖的一次性提取进行了初步研究，以过80目分样筛板栗干粉1.000 0g，1∶40的料液比为固定値，设置不同的浓度(氢氧化钠溶液mol/L)、温度、时间为变量做单因素实验，研究板栗多糖提取的最优条件参数.结果表明：板栗多糖的一次性提取最优参数为：碱溶液浓度1.5mol/L，提取时间为90min，提取温度为80℃.该试验仅为此方法的初步研究，碱提法下影响板栗多糖提取效果的因素还有很多，如料液比、样品颗粒大小、提取次数及这些因素影响力大小的正交试验等都还需我们经一步的研究.

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Optimization for Alkali Type Method Extraction of Castanea mollissima Polysaccharide

ZHANG Ze-jun1, WANG Wu-chun1, LI Yan1, MA Yuan-keng1, SHI Rui1, CHEN Xiang-gang2

(1.School of Chemistry and Life Science, Zhaotong University, Zhaotong 657000， China; 2.Beizha Middle School, Zhaotong 657000， China)

zhaotong’s chestnut powder as raw material, it’s polysaccharide were extracted with alkali method. By sevage reagent to remove protein, ethanol precipitation, organic solvents, anhydrous ethanol, acetone and petroleum ether. after washing to take off fat by anthrone colorimetry of sulfuric acid solution-determination of its content, through the single factor experiment method in fixed ratio (1∶40), particle size of material liquid sample (80 mesh sieve) study of different concentration, time, temperature under the condition of the optimal extraction parameters.The results show that the optimal extraction parameters for the extraction of the concentration of 0.5mol/L, 90min extraction time, extraction temperature 80℃, under the optimal extraction parameters extraction a withdrawal rate is as high as 26.47%.

Castanea mollissima; Polysaccharides; Alkali extraction; Optimization

2016-08-18

云南省科技厅应用基础研究项目(青年项目)(2013FD057).

张泽俊(1983— )，男，云南昭通人，讲师，硕士，主要从事功能材料的合成与色谱分析研究.

TS255.1

A

2095-7408(2016)05-0043-04