创面复合液体敷料在皮肤创伤中的治疗研究

陈燕培 夏栋林 王雨飞 陈 超 沈铃玲 顾海鹰1， 何 红

1(南通大学杏林学院，江苏 南通 226019)2(南通大学公共卫生学院，江苏 南通 226019)3(南通通大化学物安全性评价中心，江苏 南通 226019)4(南通大学航海医学研究所，江苏 南通 226019)5(南通大学附属医院，江苏 南通 226001)

创面复合液体敷料在皮肤创伤中的治疗研究

陈燕培1†夏栋林2†王雨飞2,3陈 超2,3沈铃玲4顾海鹰1，2,3何 红5*

1(南通大学杏林学院，江苏 南通 226019)2(南通大学公共卫生学院，江苏 南通 226019)3(南通通大化学物安全性评价中心，江苏 南通 226019)4(南通大学航海医学研究所，江苏 南通 226019)5(南通大学附属医院，江苏 南通 226001)

基于羧甲基壳聚糖的高生物相容性及聚乙烯醇缩丁醛的快速成膜，构建了一种创面复合液体敷料，并对其应用效果进行评价。首先应用羧甲基壳聚糖 (CMC)、聚乙烯醇缩丁醛 (PVB)和乙醇溶液，按照一定的比例，制备创面复合液体敷料。对其防水、透气、阻菌、细胞毒性进行性能研究及安全性评价。然后选择健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，雌雄各半，构建大鼠创面模型，并将含有不同浓度的羧甲基壳聚糖(1.0、10.0、30.0 mg/mL)应用在其创面上，通过日常观察、HE染色等，研究创面复合液体敷料在皮肤创伤中的治疗效果。结果显示创面复合液体敷料上层膜液在1.8～2.3 mm 之间具有很好的防水透气性、阻菌性及生物兼容性。运用在动物模型上可以看到，第7 d含有10.0、30.0 mg/mL CMC组的大鼠创面愈合率分别为65.42%、67.38%，明显高于对照组且存在显著性差异(P< 0.01)，14 d后含有10.0、30.0 mg/mL CMC组的大鼠创面愈合率已达到100%。HE 染色的第七天含有10.0、30.0 mg/mL CMC的创面复合液体敷料组中观察到有复层扁平的表皮和真皮的胶原纤维，第12 d组织开始出现内陷结构，含有厚实、粗糙胶原纤维的正常真皮与较薄的胶原纤维水平连接，表皮的复层鳞状上皮远远大于对照组中的三到四层。而且创面连接真皮结缔组织，它的表皮构成非常接近于正常皮肤组织。构建的创面复合液体敷料(10.0 mg/mL CMC)具备良好的防水、透气、阻菌性以及生物兼容性，随着羧甲基壳聚糖浓度的升高，治疗急性创面的效果越好，创面复合液体敷料能够对创面起到早期保护和促进愈合的效果。.

创面复合液体敷料；急性皮肤溃疡模型；羧甲基壳聚糖；聚乙烯醇缩丁醛

引言

随着皮肤创面二次污染的机会增加，继发感染也日益增多，从而加剧了清创的难度及抗生素的大量应用，不但给病人带来痛苦，也会延迟创面的愈合。对开放性创伤中预防感染是重要环节之一，传统的处理主要是用纱布包扎，常常收到外界水和细菌的污染[1]。早期使用能够快速覆盖的创面预防感染的敷料，促进愈合是首选。

一个理想的敷料应该具备3个条件：一是适合的水蒸气透过率(MVTR)，既能够为创面提供湿润的环境，又能够防水；二是阻菌，防止外界细菌对创面的污染；三是安全性高，不会产生二次伤害[2-3]，能够提供适合细胞生长、迁移的微环境，促进皮肤愈合。

研究表明羧甲基壳聚糖能够促进皮肤细胞的生长，并且抑制瘢痕形成，另外，羧甲基壳聚糖具有一定的抑菌性能，能够预防细菌对创面的感染。本研究中利用羧甲基壳聚糖能够促进创面愈合及聚乙烯醇缩丁醛(PVB)的快速成膜的性能，构建一种创面复合液体敷料，通过对其防水、透气、阻菌性能、安全性进行评价，找到组合的最佳比例，并将其应用在SD大鼠创面模型中进行效果评价[4]。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物：Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，雌雄各半，体重200～220 g，由浙江省医学科学院提供，合格证号SCXK(浙)2014—0001，自由摄食饮水，光照：12 h明/12 h暗，在实验室饲养1周后进入实验。

1.2 实验仪器

TSJ-Q全自动封闭式组织脱水机、BMJ-III型组织包埋机、PHY-III型病理组织漂洪仪均购自常州中威电子仪器有限公司，HM315R石蜡切片机购自上海倍曼生物科技有限公司。

1.3 实验材料

羧甲基壳聚糖(CMC)购自上海海曲公司，聚乙烯醇缩丁醛(PVB)购自上海第一试剂厂，乙酸乙酯购自南京化学试剂有限公司，MTT购自Ruibio(德国)，粘质沙雷菌由南通大学附属医院检验中心赠送，小鼠成纤维细胞(L929)购自上海酶联生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 创面复合液体敷料的制备

本实验中制造的新型创面复合液体敷料分上下二层，具体制备过程如下：

上层膜液：将2.0 g/mL PVB溶于50 mL乙酸乙酯并与95%乙醇(1∶8 V/V)混合，(37±0.5)℃恒温水浴箱中放置过夜至完全溶解，然后保存在密闭的容器中。

下层膜液：将CMC溶于生理盐水分别配成1.0、10.0及30.0 mg/mL的溶液。

组合：将适量下层膜液滴加在创面上，再在其上涂加上层膜液，静置30 s后成膜，即得到创面复合液体敷料。

1.4.2 防水性试验

将上层膜液倒入培养皿中，制成厚度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mm的膜，按照国家医药行业标准《接触性创面敷料试验方法第3部分：阻水性》(YY/T 0471.3—2004)对上层膜的防水性进行测试，具体如下：将膜裁剪成1 cm×2 cm大小，且固定在容器的底部，并在容器中加注500 mm静水压，出现渗水计时停止。

1.4.3 透气性(MVTR)试验

按照国家医药行业标准《接触性创面敷料试验方法第2部分：透气膜敷料水蒸气透过率》(YY/T 0471.2—2004)进行透气性测试，具体如下：将上层膜(厚度与防水性试验相同)固定在瓶口面积为10 cm2的容器口，容器内放满水，并计重W1。在恒温为(37±0.5)℃、相对湿度<20%的空间里放置24 h后再称量W2，并计算透气性。

MVTR=(W1-W2)×10 000×24/T

(1)

1.4.4 阻菌性试验

按照接触性创面敷料阻菌性试验方法标准[5]对上层膜的阻菌性能进行测试，检查被样品覆盖的表面积内是否有粘质沙雷菌红色菌落生长。

1.4.5 生物相容性评价

按照Borghi报道的方法[6]进行实验，实验组分别为上层膜的DMEM培养基浸提液及1.0、10.0及30.0mg/mLCMC创面复合液体敷料，组别分别设为实验组a、实验组b、实验组c、实验组d。然后对其生物兼容性进行评价。

1.4.6 建立皮肤溃疡模型及分组

参照周氏造模方法，选取SD大鼠40只，雌雄各半，体重200～220g。在SD大鼠背部造直径为1cm创面，深至筋膜。将造模成功的SD大鼠随机分成4组：对照组及创面复合液体敷料治疗组(CMC浓度分为1.0、10.0、30.0mg/mL等3组)。创面复合液体敷料的治疗是先在大鼠体表皮肤创面处先涂下层膜液，然后再涂抹上层膜液，30s左右上层膜液即成膜。

1.4.7 愈合面积及病理

分别在1、4、7、11d观察动物创面，并拍摄照片，采用photoshop计算其面积，绘制未愈合伤口面积随时间的变化曲线。分别在7和12d处死动物，进行组织病理学观察。

1.5 统计学分析

使用SPSS 13.0对各组实验数据做单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面复合液体敷料的构建

构建的创面复合液体敷料的结构如图1所示，该敷料包括上下两层，在使用前均为液体。使用时先将底液涂抹在创面上，形成凝胶，覆盖整个创面，然后在其上涂抹上层膜液，膜液会迅速形成膜，并且与周围皮肤良好的结合，对创面进行封闭，能够有效地对创面形成保护。

2.2 创面复合液体敷料的防水透气性

构建的创面复合液体敷料的防水、透气主要由上层膜起作用，因此对上层膜的防水、透气性进行测试，结果见图2。随着膜厚度的增加，防水性能不断提高，厚度约为1.79 mm在300 s时出现渗水，厚度达到3 mm时，则超过700 s都不会有渗水现象。

图2 创面复合液体敷料上层膜的防水、透气性Fig.2 Waterproof and permeability of the upper layer of wound composite liquid dressing

膜的透气性伴随的膜厚度的增加而下降，当膜的厚度为2.3 mm时，透气率低于1 000 g·m-2·24 h-1，当膜的厚度进一步增加，达到3 mm时，透气率低于150 g·m-2·24 h-1。根据前期研究[7]，优良的皮肤敷料防水时间应该超过300 s，透气率的理想值应高于1 000 g·m-2·24 h-1，因此该复合液体敷料的上层膜液的厚度应选择在1.8～2.3 mm之间。

2.3 阻菌性

阻菌性主要由上层膜起作用。在本试验中，上层膜的厚度选择1.8 mm，结果见图3。经过培养，对照组(纱布)有黏质沙雷氏菌的生长，而上层膜没有产生黏质沙雷氏菌，说明上层PVB膜具有良好的阻菌性，能够起到良好的阻挡外界细菌对创面污染的作用。

图3 创面复合液体敷料的阻菌性结果 (a) 对照组；(b) 实验组Fig.3 The result of bacterial resistance for the wound composite liquid dressing (a)control group; (b)experimental group

2.4 细胞毒性评价

从图4 中可以看出，对照组、实验组a、实验组b、实验组c、实验组d的OD值分别为1.239、1.207、1.341、1.091、0.972。由OD值可以得出上层膜液形成膜后的浸提液无细胞毒性。创面复合液体敷料其下层的底液为1.0、10.0、30.0 mg/mL 羧甲基壳聚糖(CMC)的浸提液对其进行评价发现，细胞毒性与测试物的浓度成正比，当浓度为30.0 mg/mL时，其OD 值与对照组比较具有统计学差异(P<0.01)。而1.0 mg/mL CMC 组的OD 值比对照组还要高，这可能是CMC能够促进细胞快速贴壁，加快了细胞的生长速度。进一步说明该创面液体复合敷料没有细胞毒性，有促进创面愈合的效果。

图4 创面复合液体敷料细胞毒性(**表示与对照组相比，P<0.01)Fig.4 Cell toxicity of the wound composite liquid dressing(*compared with the control, P<0.01)

2.5 伤口愈合结果

图5中第4 d各组创面愈合率出现差异，分别为17.69%、31.13%、36.58%、34.10%。可以看出，含有10.0 mg/mL CMC组与对照组比较具有差异性(P<0.05)；第7 d含有10.0、30.0 mg/mL CMC组的大鼠创面愈合率分别为65.42%、67.38%，明显高于对照组且存在显著性差异(P<0.01)。同时，从图6看以观察到，对照组结痂不明显，并且创面仍未有愈合的迹象；在10.0、30.0 mg/mL CMC的复合液体敷料组的痂已较好地覆盖了创面，同时创面面积在不断减小。这进一步说明，当CMC浓度大于10.0 mg/mL时，能够快速促进创面的愈合。

图5 大鼠创面愈合率(与对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01)Fig.5 The rate of Wound healing in rats(compared with the control, *indicates P<0.05,** indicates P<0.01)

图6 大鼠第7 d创面愈合。 (a) 对照组；(b) 1.0 mg/mL CMC；(c) 10.0 mg/mL CMC;(d) 30.0 mg/mL CMCFig.6 Schematic diagram of wound healing in seventh days of rats. (a) Control group； (b) 1.0 mg/mL CMC；(c) 10.0 mg/mL CMC;(d) 30.0 mg/mL CMC

2.6 病理结果

图7 大鼠皮肤组织第7 d。 (a) 对照组；(b) 1.0 mg/mL CMC；(c) 10.0 mg/mL CMC; (d) 30.0 mg/mL CMCFig.7 HE staining in seventh days for skin tissue of rat. (a) Control group； (b) 1.0 mg/mL CMC；(c) 10.0 mg/mL CMC; (d) 30.0 mg/mL CMC

对7和12 d进行病理检查。从图7中可以看出，在7 d对照组中没有观察到表皮的形成，并且有炎症。在1.0 mg/mL CMC的复合液体敷料组中，有几层薄薄的表皮覆盖在伤口区域，还有一个不完整的粒状组织。而10.0、30.0 mg/mL CMC的复合液体敷料组中观察到有复层扁平的表皮和真皮的胶原纤维。

在12 d时，可以观察到10.0、30.0 mg/mL CMC的复合液体敷料组中组织开始出现内陷结构，含有厚实、粗糙胶原纤维的正常真皮与较薄的胶原纤维水平连接，表皮的复层鳞状上皮远远大于对照组中的3～4层。而且，创面连接真皮结缔组织，它的表皮构成非常接近于正常皮肤组织。

图8 大鼠皮肤组织第12 d HE染色。 (a) 对照组；(b) 1.0 mg/mL CMC；(c) 10.0 mg/mL CMC; (d) 30.0 mg/mL CMCFig.7 HE staining in seventh days and 12 days for skin tissue of rat. (a) Control group； (b) 1.0 mg/mL CMC； (c) 10.0 mg/mL CMC;(d) 30.0 mg/mL CMC

3 讨论

当皮肤遭受急性损害时，外界的细菌、污物等会侵蚀创面，极易引起创面感染，从而造成创面的修复时间延长[8]。因此，构建一种能够及时并有效地覆盖创面的敷料，防止外界细菌感染，控制创面细菌数量，能够加快创面的愈合。目前传统的用于创面伤口护理的敷料主要是纱布、创可贴等，存在很多缺点，如易与创面粘连，换药时会产生二次损伤，加重患者疼痛感，另外纱布无法阻挡外界细菌感染等[9]。传统的愈合观念被‘湿性愈合’观念打破。1962年，George Winter首先提出了湿性愈合，他发现湿润环境下的创面愈合速度是干燥环境下的2倍，这是因为创面周围湿润环境能够促进创面边缘细胞迁移[10]。随着敷料的迅速发展，湿性敷料开始占据整个敷料市场发展的主导位置。市面上常见的液体敷料主要是混合型液体创贴，干燥速度较慢，生物兼容性差，防水、透气不能同时具备[11-12]。因此，我们制备了一种快速覆盖皮肤创面的复合液体敷料。该复合液体敷料上层膜液能够快速成膜，防止二次污染，并具备良好的防水、透气性；下层膜液能够为创面提供湿润的环境，从而使伤口快速愈合。

水蒸气渗透率是决定敷料舒适度一个很重要的因素。理想的敷料应保持最优的水蒸气传输速率和防水率。Queen等报道：透气率在1 000～2 500 g-2d-1之间将提供充足的水分，防止脱水及渗出液积聚。但当高于2 500 g-2d-1时会让伤口更快地干涸，产生疤痕；低于1 000 g-2d-1时积累渗出，这将导致增长细菌的风险。本文研制的复合液体敷料的防水透气膜厚度低于2.3 mm时，透气率超过1 000 g-2d-1。另外，防水性也是皮肤敷料一个重要的指标，随着防水膜的厚度减少到1.79 mm，膜在300 s时开始出现渗水。因此，复合液体敷料的上层膜的膜厚度应该在1.8～2.3 mm之间比较合适。能够起到良好的防水、透气及阻菌的作用。

羧甲基壳聚具有良好的水溶性和更快的生物降解性[13]，大大拓展了应用领域。如其能促进细胞生长及修复的能力[14]，亦可作为药物缓释控制[15]及神经修复材料[16]，也能止血[17]。本研究中利用了羧甲基壳聚在创面修复方面的特性，避免上层膜液与创面直接接触，减少了皮肤产生炎症反应。敷料中的羧甲基壳聚糖的浓度越大，创面愈合的效果越好，故该创面复合液体敷料的底液CMC的浓度选择10.0 mg/mL。

4 结论

本研究所制备的创面复合液体敷料分为两层，上层是以PVB膜液，下层以羧甲基壳聚糖为主的胶液。上层膜液速干，与创面紧密贴合，防水、抗菌、透气，并为底液提供湿润、无菌的良好愈合环境。下层羧甲基壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性，且无毒副作用，可明显促进正常皮肤成纤维细胞的增殖，从而抑制瘢痕疙瘩皮肤成纤维细胞的增殖，防止疤痕增生，有利于外观和功能的恢复，使伤口得到高质量愈合。从动物实验中，创面复合液体敷料能够快速促进创面愈合，提高创面愈合的质量。所以，利用创面复合液体敷料能使创面的及早覆盖，能够有效减少感染的风险，加快创面的愈合。

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The Fabrication of Composite Liquid Dressing and Applications in Skin Wound Healing

Chen Yanpei1†Xia Donglin2†Wang Yufei2,3Chen Chao2,3Shen Lingling4Gu Haiying1,2,3He Hong5*

1(NantongUniversityXinglinCollege,Nantong226019,Jiangsu,China)2(SchoolofPublicHealth,NantongUniversity,Nantong226019,Jiangsu,China)3(NantongTongdaChemicalsSafetyEvaluationCenterCo.LTD,Nantong226019,Jiangsu,China)4(InstitueofNauticalMedicine,NantongUniversity,Nantong226019,Jiangsu,China)5(AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,Jiangsu,China)

The aim of this study is to investigate the effect of the composite liquid dressing in the treatment of acute skin ulcer for further applications in the prevention of surgical wound infection and promotion of wound healing. The composite liquid dressing (CLD) was prepared by carboxymethyl chitosan (CMC), polyvinyl butyral (PVB) and ethanol solution, according to the certain formulation. The performance and biological safety of CLD were evaluated by experiments of waterproof, breathable, bacteria resistance, and cell toxicity. Forty healthy adult SD rats, half male and half female, were made wound, carboxymethyl chitosan meanwhile different concentration at 1.0 mg/mL, 10.0 mg/mL, 30.0 mg/mLwas applied to the wound. The therapeutic effect of the wound composite liquid dressing was studied by daily observation and HE staining. The upper membrane liquid of CLD between 1.8～ 2.3 mm had very good waterproof permeability and resistance to bacteria. In animal models, the wound healing rate of the experimental group (10.0 and 30.0 mg/mL CMC) was 65.42% and 67.38%, which was higher than that of control group with significant difference (P< 0.01) on the 7thday. The wound healing rate of the experimental group (10.0 and 30.0 mg/mL CMC) was 100% on the 14thday. Seven days after the operations, the wound healing rate of the experimental group (10.0 and 30.0 mg/mL CMC), the stratified squamous epithelium that formed the epidermis and the dermis consisted of thin collagen fibers. The organization began to fall into the interior; the normal dermis with a thick, coarse collagen fiber was connected to a thin collagen fiber. The stratified squamous epithelium of the epidermis was much larger than that of the control group from 3 to 4. The wound was connected with dermal connective tissue. The skin was very close to the normal skin on the 12thday. The results showed that the dressing functioned (10.0 mg/mL CMC ) as a good barrier against the penetration of infection, it was waterproof, had a suitable water vapor transmission rate, good biosafety and a rapid wound closure rate.

new composite liquid dressing; acute skin ulcer model; carboxymethyl chitosan; polyvinyl butyral

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 04.009

2015-09-16， 录用日期:2016-04-12

江苏省自然科学基金(BK2012651)

R318

A

0258-8021(2016) 04-0453-07

†共同第一作者

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: honghe@ntu.edu.cn