假丝酵母菌性外阴阴道病不同基因型致病菌株药物敏感性比较

祁文瑾，李白鸾，钱 源



假丝酵母菌性外阴阴道病不同基因型致病菌株药物敏感性比较

祁文瑾，李白鸾，钱 源

【摘要】目的对妊娠与非妊娠假丝酵母菌性外阴阴道病(VVC)致病菌株进行基因分型，并初步探讨不同基因型菌株对抗真菌药物是否存在敏感性差异。方法选取2011—2014年在昆明医科大学第一附属医院妇产科门诊就诊的VVC患者373例，其中非妊娠VVC患者197例，妊娠(10～40周)VVC患者176例。以科玛嘉显色培养基和VITEK 2系统鉴定致病菌菌种，采用改良的微量平板稀释法进行克霉唑、制霉菌素和咪康唑的体外药敏实验，特异引物PCR对致病白假丝酵母菌基因分型，并对不同基因型致病菌的体外药敏结果进行比较。结果非妊娠VVC患者检出白假丝酵母菌166株(84.26%)，妊娠VVC患者检出白假丝酵母菌134株(76.14%)，妊娠VVC患者白假丝酵母菌检出率低于非妊娠VVC患者，差异有统计学意义(χ2=3.901，P=0.048)。妊娠与非妊娠VVC患者致病白假丝酵母菌克霉唑、咪康唑最小抑菌浓度(MIC)值均低于非白假丝酵母菌(妊娠：Z克霉唑=6.275，P<0.001；Z咪康唑=5.102，P<0.001；非妊娠：Z克霉唑=3.095，P=0.002；Z咪康唑=2.169，P=0.030)；妊娠VVC致病白假丝酵母菌咪康唑、制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者(Z=3.074，P=0.002；Z=4.982，P<0.001)。妊娠VVC致病白假丝酵母菌对克霉唑、咪康唑敏感率较高(≥91.04%)，少有耐药菌株；非妊娠VVC致病白假丝酵母菌菌株对克霉唑敏感率达96.38%。妊娠VVC患者A基因型菌株113株，B基因型菌株10株，C基因型菌株11株；非妊娠VVC患者分别为152、5、9株，两组患者不同基因型白假丝酵母菌菌株构成比比较，差异无统计学意义(χ2=4.189，P=0.114)。妊娠VVC患者A基因型菌株的咪康唑MIC值高于非妊娠VVC患者A基因型菌株(Z=2.804,P=0.005),而制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者A基因型菌株(Z=4.869，P<0.001)。妊娠VVC致病白假丝酵母菌B、C基因型菌株全部对克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型菌株敏感率分别为91.15%、89.38%；非妊娠VVC致病白假丝酵母菌B基因型菌株全部对克霉唑、制霉菌素敏感，C基因型菌株全部对克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型对克霉唑、制霉菌素、咪康唑敏感率分别为94.74%、69.08%、80.30%。结论非妊娠VVC患者可优先选择克霉唑治疗，妊娠VVC患者可优先选择咪康唑治疗。妊娠与非妊娠VVC患者白假丝酵母菌均以A基因型最为多见，且不同基因型白假丝酵母菌对抗白假丝酵母菌药物的敏感性存在差异。

假丝酵母菌性外阴阴道病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一种常见的妇产科感染性疾病，妊娠妇女阴道假丝酵母菌的感染率高于非妊娠妇女，可能导致流产、早产、胎膜早破及新生儿感染等不良妊娠结局[1-2]。由于用药限制，妊娠期VVC治疗相对困难。本研究对妊娠和非妊娠VVC患者的阴道致病假丝酵母菌进行基因分型和体外药敏研究，探讨致病菌株本身的基因型差异是否对抗真菌药物的敏感性存在影响，为进一步有效治疗妊娠和非妊娠VVC患者提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料选取2011—2014年在昆明医科大学第一附属医院妇产科门诊就诊的VVC患者373例，其中非妊娠VVC患者197例，年龄18～45岁，平均年龄(27.4±5.6)岁；妊娠VVC患者176例，年龄20～43岁，平均年龄(29.0±3.5)岁，妊娠10～40周。患者均有外阴瘙痒、阴道分泌物异常等典型VVC症状，假丝酵母菌镜检、培养阳性，且不存在免疫相关性疾病及糖尿病等合并症，无长期抗生素使用史。

1.2研究方法

1.2.1菌种鉴定患者均于阴道后穹隆处收集阴道分泌物，接种于沙堡罗氯霉素培养基(法国-生物梅里埃公司)，37 ℃恒温箱培养24～48 h，有乳酪状假丝酵母菌菌落生长为培养阳性，挑取单菌落接种于斜面培养基保存，以科玛嘉显色培养基(法国科玛嘉公司生产，郑州博赛公司分装)和VITEK 2酵母菌鉴定卡(法国-生物梅里埃公司)进行菌种鉴定。标准株为白假丝酵母菌ATCC90028，购自美国细胞典藏中心。

1.2.2药敏实验参考美国临床和实验室标准协会的抗真菌药物敏感实验标准(CLSI/NCCLS)，以改良的微量平板稀释法进行FDA分类B类药物克霉唑、制霉菌素，C类药物咪康唑(美国Sigma化学制剂公司，纯度>99.9%)的体外药敏实验，药物终浓度均为0.031 3～16.000 μg/ml[3-4]。

最小抑菌浓度(MIC)值：以96孔U型细胞培养板进行，菌液最终浓度为(1～5)×103CFU/ml，35 ℃温箱孵育24～48 h观察结果，根据显色指示剂Alamar blue(英国Serotec公司)的颜色变化判别MIC值，质控菌株为克柔假丝酵母菌ATCC 6258和近平滑假丝酵母菌ATCC 22019，购自美国细胞典藏中心。

1.2.3白假丝酵母菌的基因分型选取经鉴定确认为白假丝酵母菌的菌株，以溶壁酶(Sigma，美国)25 ℃处理24 h破壁[5]，北京庄盟国际生物基因科技有限公司ZP302酵母基因组DNA小量提取试剂盒抽提DNA。基因分型采用特异引物聚合酶链反应(INT-PCR)进行，引物参考文献[5]设计，序列为CA-INT-L(5′-ATAAGGG AAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-3′)，CA-INT-R(5′-CCTTGGCTGTGGTTTCG CTAGATAGTAGAT-3′)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR以25 μl体系进行扩增，含有10×buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.25 μl，Taq酶(5 μg/μl)0.25 μl，引物各(100 pmol/μl)0.15 μl，基因组DNA约25 ng。95 ℃预变性4 min，按94 ℃变性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，72 ℃延伸4 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶(EB)染色，于紫外灯下观察并摄片保存结果。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，计数资料的分析采用χ2检验；不同菌株的药物MIC值比较采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1致病假丝酵母菌菌种鉴定结果非妊娠VVC患者检出白假丝酵母菌166株(84.26%)，非白假丝酵母菌31株(15.74%)；妊娠VVC患者检出白假丝酵母菌134株(76.14%)，非白假丝酵母菌42株(23.86%)。妊娠VVC患者白假丝酵母菌检出率低于非妊娠VVC患者，差异有统计学意义(χ2=3.901，P=0.048)。

非妊娠VVC患者共检出非白假丝酵母菌6种，其中光滑假丝酵母菌12株(38.71%)；妊娠VVC患者共检出非白假丝酵母菌8种，其中光滑假丝酵母菌19株(45.24%)。所有VVC患者阴道致病非白假丝酵母菌构成比见表1。

表1妊娠与非妊娠VVC患者阴道非白假丝酵母菌鉴定结果

〔n(%)〕

Table 1Identification results of non candida albicans candida species in the vagina of pregnant VVC patients and non-pregnant VVC patients

菌种妊娠VVC患者非妊娠VVC患者光滑假丝酵母菌19(45.24)12(38.71)克柔假丝酵母菌5(11.91)4(12.90)热带假丝酵母菌8(19.05)7(22.58)近平滑假丝酵母菌3(7.14)3(9.68)季也蒙假丝酵母菌2(4.76)3(9.68)法式假丝酵母菌2(4.76)2(6.45)挪威假丝酵母菌1(2.38)0 其他假丝酵母菌2(4.76)0

2.2妊娠与非妊娠VVC患者体外药敏实验结果妊娠与非妊娠VVC患者致病白假丝酵母菌克霉唑、咪康唑MIC值均低于非白假丝酵母菌(Z妊娠克霉唑=6.275，P<0.001；Z妊娠咪康唑=5.102，P<0.001；Z非妊娠克霉唑=3.095，P=0.002；Z非妊娠咪康唑=2.169，P=0.030)；妊娠VVC致病白假丝酵母菌咪康唑、制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者(Z=3.074，P=0.002；Z=4.982，P<0.001)，妊娠VVC致病非白假丝酵母菌制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC致病非白假丝酵母菌患者(Z=2.672，P=0.008)，克霉唑MIC值高于非妊娠VVC致病非白假丝酵母菌患者(Z=5.273，P<0.001，见表2)。

根据CLSI标准和文献报道[3-4，6-7]界定的MIC节点值：咪康唑0.5～8.0 μg/ml，克霉唑1.0～16.0 μg/ml，制霉菌素4.0～8.0 μg/ml，将所有菌株分为敏感、中敏和耐药菌株，结果显示：妊娠VVC致病白假丝酵母菌对克霉唑、咪康唑的敏感率较高(≥91.04%)，对制霉菌素敏感率也高达89.55%；致病非白假丝酵母菌对咪康唑、制霉菌素敏感率约为90%，但对克霉唑敏感率仅为47.62%。非妊娠VVC致病白假丝酵母菌对克霉唑敏感率达96.38%，对制霉菌素敏感率为69.88%，非妊娠VVC致病非白假丝酵母菌对克霉唑敏感率达100.00%，对制霉菌素敏感率为80.65%(见表2)。

2.3不同基因型阴道致病假丝酵母菌药敏分析应用INT特异引物对已鉴定确认为白假丝酵母菌的非妊娠和妊娠VVC致病菌株进行扩增后，菌株均可扩增出清晰的450 bp和/或840 bp DNA片段，据此可将全部致病白假丝酵母菌分为A、B、C 3型：仅有450 bp片段者为A型(标准株ATCC90028即属于该基因型)，仅有840 bp片段者为B型，两条片段均有为C型(见图1)。妊娠与非妊娠VVC患者不同基因型白假丝酵母菌菌株构成比比较，差异无统计学意义(χ2=4.189，P=0.114)。

妊娠VVC患者A基因型菌株的咪康唑MIC值高于非妊娠VVC患者A基因型菌株(Z=2.804,P=0.005),而制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者A基因型菌株(Z=4.869，P<0.001)。妊娠VVC致病白假丝酵母菌B、C基因型菌株全部对克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型菌株的敏感率分别为91.15%、89.38%；非妊娠VVC致病白假丝酵母菌B基因型菌株全部对克霉唑、制霉菌素敏感，C基因型菌株全部对克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型对克霉唑、制霉菌素、咪康唑的敏感率分别为94.74%、69.08%、80.30%(见表3)。

注：M=DL2000分子量标准，1=标准株ATCC90028，B=B基因型菌株，C=C基因型菌株，其余未标出均为A基因型

图1白假丝酵母菌INT-PCR扩增结果

Figure 1INT-PCR amplificantion results of candida albicans

3讨论

本研究中，非妊娠VVC患者阴道白假丝酵母菌检出率为84.26%，与何亮等[8]白假丝酵母菌检出率为84.91%的结果接近，略高于国外76.3%的报道[9]，妊娠VVC患者阴道白假丝酵母菌检出率为76.14%，低于非妊娠VVC患者，提示无论妊娠与否，VVC患者的阴道致病假丝酵母菌均以白假丝酵母菌最为多见，但妊娠期白假丝酵母菌比例降低而非白假丝酵母菌比例增加。体外药敏结果MIC值比较显示，非妊娠VVC致病白假丝酵母菌克霉唑、咪康唑MIC值均低于非白假丝酵母菌，但妊娠VVC患者咪康唑、制霉菌素MIC值均低于非妊娠VVC患者；除证实白假丝酵母菌对抗真菌药物相对敏感外，还提示妊娠VVC患者对某些药物的敏感性与非妊娠VVC患者存在一定差异，其机制可能与妊娠期VVC治疗用药局限性减少了继发性药物敏感性降低有关，但这一推论还需更多研究证实。

表2　妊娠与非妊娠VVC患者致病菌体外药敏实验MIC值

表3　不同基因型白假丝酵母菌对不同抗真菌药物的敏感性分析

CLSI的M27-A方案是国际公认的假丝酵母菌体外药敏研究金标准[3]，但该标准并未给出咪康唑和制霉菌素的MIC节点值。因此，本研究根据所测药物MIC值，综合CLSI标准和既往文献报道确定了3种药物的节点值，将所有菌株分为敏感、中敏和耐药菌株进行进一步分析比较[3-4，6-7]。结果提示：对于白假丝酵母菌所致妊娠VVC患者，3种药物均可选择，克霉唑、咪康唑略优，而非白假丝酵母菌所致妊娠VVC患者可优先选择制霉菌素和咪康唑；对于非妊娠VVC患者，无论致病菌种如何，克霉唑均可优先选择，咪康唑为次选。

假丝酵母菌的rDNA为串状重复序列，包括编码25S、18S、5.8S的基因，本研究所采用的INT引物是针对白假丝酵母菌的25S rRNA设计的特异引物，该区包括459个基因序列，可扩增450 bp片段(A基因型)，在该区域插入大小为379 bp的基因即可扩增出840 bp片段(B基因型)，若同时扩增出450 bp和840 bp片段则为C基因型。本研究中，所有致病白假丝酵母菌经特异INT引物PCR扩增后，均获得清晰而稳定的条带，检测成功率100%，VVC患者致病白假丝酵母菌均同时具有A、B、C 3种基因型，且以A基因型最为多见；妊娠与非妊娠患者并不存在不同基因型构成比的差异。

分析A、B、C 3种基因型白假丝酵母菌对上述3种抗真菌药物的敏感性差异，结果显示：妊娠VVC患者A基因型菌株的咪康唑MIC值高于非妊娠VVC患者A基因型菌株,而制霉菌素MIC值低于非妊娠VVC患者A基因型菌株。进一步分析不同基因型菌株对3种药物的敏感、中敏和耐药菌株构成比可以看出：妊娠VVC致病白假丝酵母菌B、C基因型菌株全部对克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型敏感菌株分别为91.15%、89.38%；非妊娠VVC致病白假丝酵母菌B基因型菌株全部对克霉唑、制霉菌素敏感，C基因型菌株全部对克霉唑、咪康唑敏感，而A基因型对克霉唑、制霉菌素、咪康唑敏感率分别为94.74%、69.08%、80.30%。上述结果提示不同基因型VVC致病白假丝酵母菌存在对抗假丝酵母菌药物的敏感性差异，不同患者中的同一基因型菌株也存在药物敏感性差异，对相关问题的进一步研究可望为将来更有效地治疗妊娠和非妊娠VVC患者提供帮助。

作者贡献：祁文瑾进行试验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；李白鸾进行质量控制、实验实施和评估；钱源进行资料收集和部分实验。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：贾萌萌)

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2016年《中国全科医学》部分专题方向预告

《中国全科医学》在借鉴WONCA大会主题内容的基础上，结合目前我国临床医学研究的热点及全科医生关注的疾病，2016年拟刊出的专题方向如下：(1)自闭症儿童的筛查、诊断和早期干预；(2)骨质疏松的治疗课题研究；(3)乳腺癌：乳腺癌研究新进展，乳腺癌筛查、预防和控制，乳腺癌治疗的最佳临床实践等；(4) 精神疾病的规范化诊断与治疗及管理；(5) 糖尿病防治新技术；(6) 哮喘治疗课题研究；(7) 结核的治疗及抗结核药物研究；(8) 肝炎的治疗课题研究；(8) 艾滋病的流行病学及临床管理。

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【关键词】念珠菌病，外阴阴道；妊娠；基因型；微生物敏感性试验

祁文瑾，李白鸾，钱源.假丝酵母菌性外阴阴道病不同基因型致病菌株药物敏感性比较[J].中国全科医学，2016，19(2)：233-237.[www.chinagp.net]

Qi WJ，Li BL，Qian Y.Comparison of susceptibility of pathogenic microorganisms of different genotypes in patients with vulvovaginal candidiasis[J].Chinese General Practice，2016，19(2)：233-237.

Comparison of Susceptibility of Pathogenic Microorganisms of Different Genotypes in Patients With Vulvovaginal CandidiasisQIWen-jin，LIBai-luan，QIANYuan.DepartmentofObstetrics&Gynecology，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversty，Kunming650032，China

【Abstract】ObjectiveTo conduct genetic typing on pathogenic microorganisms in pregnant and non-pregnant patients with vulvovaginal candidiasis(VVC)and investigate the difference in the susceptibility of pathogenic microorganisms of different genotypes towards antifungal drugs.MethodsWe enrolled 373 VVC outpatients who were treated in the Department of Obstetrics & Gynecology of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical Universty from 2011 to 2014，among which 197 patients were not pregnant and 176 pateins were pregnant(10 weeks to 40 weeks).Using CHROM agar Salmonella Medium and Vitek 2 system，the pathogenic microorganisms were identified.In vitro tests on drug sensitivity to clotrimazole，nystatin and miconazole were conducted using the improved version of trace plate dilution method.Specific primer PCR was used to congduct genetic typing on pathogenic candida albicans.In vitro chemo-drug sensitive tests were undertaken on candida isolates with different genotypes of VVC.ResultsA total of 166(84.26%)stains of candida albicans were detected in non-pregnant VVC patients，and 134(76.14%)stainswere detected in pregnant VVC patients.Pregnant VVC patients had lower detection rate of candida albicans than non pregnant VVC patients(χ2=3.901，P=0.048).In all patients，the MIC values of clotrimazole and miconazole of pathogenic candida albicans were lower than non candida albicans candida species(pregnant:Zclotrimazole=6.275，P<0.001；Zmiconazole=5.102，P<0.001；non-pregnant:Zclotrimazole=3.095，P=0.002；Zmiconazole=2.169，P=0.030)；pregnant patients had lower MIC values of miconazole and nystatin than non pregnant patients(Z=3.074，P=0.002；Z=4.982，P<0.001).Pregnant patients had high proportion(≥91.04%)of strains of pathogenic candida albicans sensitive to clotrimazole and miconazole，and strains with drug resistance was in a small proportion；non-pregnant patients had high proportion(96.38%)of strains of pathogenic candida albicans sensitive to clotrimazole.In pregnant patients，there were 133 strains of A genotype，10 strains of B genotype and 11 strains of C genotype，and the numbers for non-pregnant patients were 152，5 and 9 respectively.The two groups were not significantly different in the proportions of candida albicans stains of different genotypes(χ2=4.189，P=0.114).Pregnant patients were higher than non-pregnant patients in the MIC value of miconazole and lower than non-pregnant in the MIC value of nystatin of strains of A genotype(Z=2.804，P=0.005；Z=4.869，P<0.001).In prenant patients，pathogenic candida albicans strains of B genotype and C genotype were all sensitive to clotrimazole and miconazole，and the proportions of pathogenic candida albicans strains of A genotype sensitive to clotrimazole and miconazole were 91.15% and 89.38% respectively；in non-pregnant patients，pathogenic candida albicans strains of B genotype were all sensitive to clotrimazole and nystatin，and those of C genotype were all sensitive to clotrimazole and miconazole，while the proportions of strains of genotype A sensitive to clotrimazole，nystatin and miconazole were 94.74%，69.08% and 80.30% respectively.ConclusionClotrimazole is the primary therapy in the treatment of nonpregnant VVC patients，while miconazole is the primary choice for pregnant VVC patients.Candida albicans strains of genotype A are the most common in either pregnant and non-pregnant VVC patients，and difference exists in candida albicans strains of different genotypes in VVC patients in the sensitivity towards anti-fungus drugs.

【Key words】Candidiasis，vulvovaginal；Pregnancy；Genotype；Microbial sensitivity tests

收稿日期：(2015-07-08；修回日期：2015-11-16)

【中图分类号】R 711.31

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.02.023

通信作者：祁文瑾，650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院产科；E-mail：wenjincookie@163.com

基金项目：作者单位：650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院产科