MAPK信号通路在炔雌醚诱导大鼠生精细胞凋亡中的作用研究

李　健，陈耀星，陈福宁，王子旭，曹　静，董玉兰

(1.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003； 2.中国农业大学动物医学院，北京 100193；3.北京昌平区中西医结合医院，北京 102208)



MAPK信号通路在炔雌醚诱导大鼠生精细胞凋亡中的作用研究

李健1*，陈耀星2，陈福宁3，王子旭2，曹静2，董玉兰2

(1.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003； 2.中国农业大学动物医学院，北京 100193；3.北京昌平区中西医结合医院，北京 102208)

摘要：旨在探讨MAPK信号通路在炔雌醚诱导大鼠生精细胞凋亡中的作用。将20只8周龄雄性SD大鼠随机分为4组，适应饲养1周后，按体重分别以0.00、0.01、0.10、1.00 mg·kg-1腹腔注射溶解于橄榄油的炔雌醚，50 μL·只-1，每天1次，连续1周。处理结束后，取睾丸并制备组织切片，通过HE染色观察睾丸组织结构的变化；通过免疫组织化学方法检测睾丸生精细胞PCNA、MAPK信号通路磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化JNK(p-JNK)及磷酸化P38(p-P38)蛋白表达，TUNEL法检测细胞凋亡。结果显示，炔雌醚处理后大鼠睾丸曲细精管上皮厚度下降，各级生精细胞数量显著减少，细胞皱缩，间隙增大，结构松散，管腔内成熟精子数量减少。生精细胞PCNA与p-ERK蛋白表达显著减少；TUNEL、p-JNK蛋白及p-P38蛋白表达则显著增加。综上表明，炔雌醚暴露通过影响MAPK信号传导通路抑制生精细胞增殖，促进细胞凋亡，最终抑制大鼠睾丸发育。

关键词：MAPK信号通路；PCNA；炔雌醚；生精细胞；凋亡

环境内分泌干扰物通过诱导氧化应激、抑制细胞增殖及促进生精细胞凋亡等途径造成一系列的生殖功能紊乱，如改变下丘脑氨基酸类神经递质浓度、减少肛殖距及间质细胞功能异常等[1-3]；但是，其造成雄性动物生殖疾病的分子机制尚未完全明确。近年来的研究热点发现MAPKs信号转导通路在正常的生理和疾病过程中均发挥至关重要的作用，如神经系统发育[4]、神经退行性病变、疼痛[5]及脑炎症[6]等疾病。MAPK丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPKs信号通路主要分为3大类，即细胞外信号调节激酶(ERKs)、c-Jun氨基末端激酶(JNKs)和P38激酶通路。MAPKs信号通路能被化学物质、氧化应激、细胞因子、神经递质及激素等细胞内外的因素激活，发生磷酸化作用。短暂激活ERKs促进细胞生存和增殖，持续激活ERKs促进细胞的分化；而短暂激活JNKs促进细胞增殖和分化，持续激活促进细胞的凋亡；P38激活下游分子原癌基因c-myc与核因子-κB(NF-κB)，促进细胞死亡。激活的MAPKs通路促进氧化应激的发生、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、促进凋亡蛋白Bax表达，并刺激细胞色素C的释放，最终上调Caspase-3、8、9，诱导细胞凋亡[7-9]。而关于炔雌醚对大鼠睾丸生精细胞MAPK信号传导通路的影响尚未见报道，因此，本试验将对有关MAPK信号传导通路在炔雌醚诱发成年大鼠生精异常过程中的作用进行研究，旨在揭示MAPK信号传导通路在环境内分泌干扰物诱发生精异常的深层作用机制。

1材料与方法

1.1试验动物处理

8周龄雄性封闭群SD大鼠(河南省实验动物中心)。平均体重(240±20) g，自由采食、饮水，在每天14 h光照，10 h黑暗的条件下进行饲喂。将20只8周龄雄性SD大鼠随机分为4组，适应饲养1周后，按体重分别以0.00、0.01、0.10、1.00 mg·kg-1腹腔注射溶解于橄榄油的炔雌醚，50 μL·只-1，每天1次，连续1周。

1.2试剂

炔雌醚购自北京紫竹药业有限公司；橄榄油购自国药集团；PCNA、TUNEL检测试剂盒、磷酸化ERK、JNK、P38检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3TUNEL法检测睾丸原位细胞凋亡

睾丸生精细胞凋亡检测按试剂盒说明进行，步骤：切片常规脱蜡至水，蛋白酶K室温孵育30 min后，PBS冲洗，擦干样品周围的PBS；3% H2O2室温孵育30 min，PBS冲洗；滴加TUNEL反应混合液(DNA末端转移酶与含dNTP混合液的反应液)，在湿盒中，37 ℃孵育60 min，PBS冲洗；滴加转化剂POD(酶标记抗荧光素抗体)，37 ℃孵育30 min，PBS(pH7.4)冲洗；滴加DAB底物溶液孵育5 min左右，苏木精复染，中性树胶封片。

1.4免疫组织化学染色

采用免疫组织化学染色检测PCNA、磷酸化ERK(p-ERK)、JNK(p-JNK)及P38(p-P38)表达。免疫组化 LAB 法染色步骤：石蜡切片常规二甲苯脱腊，梯度酒精入水；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次5 min；将组织切片用100%甲醇配制的3% H2O2封闭，室温下30 min；微波抗原修复10 min，取出后自然冷却至室温；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次 10 min；5% 正常山羊血浆(用 0.01 mol·L-1PBS 配制)室温下30 min；加入一抗兔抗 Caspase-3(1∶100)抗体，4 ℃ 孵育过夜；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次5 min；生物素标记的山羊抗兔 IgG(1∶200，用 0.01 mol·L-1PBS 配制)，室温孵育2 h；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次 10 min；三抗，室温下1.5～2.0 h；0.05 mol·L-1Tris-HCl buffer(pH 7.2)漂洗2次，10 min以上；DAB 孵育：0.05 mol·L-1Tris-HCl 配制0.05%的 DAB 孵育液，孵育 20 min；DAB 显色：0.05% DAB/H2O2，呈色2～10 min；0.05 mol·L-1Tris-HCl buffer(pH 7.2)漂洗3次，每次 10 min；脱水，透明，封片。

分别设置阴性对照，对照组与试验组同时按上述步骤处理，用 PBS代替一抗，其它步骤完全相同。上述所有孵育过程均在湿盒中进行。TUNEL检测和免疫组织化学染色结果描述：弱阳性(浅棕色)和强阳性(深棕色)。TUNEL法检测与免疫组织化学染色的阳性细胞统计分别在各组大鼠睾丸切片上进行，统计1 000个生精细胞(包括精原细胞、精母细胞、精子细胞和间质细胞)中阳性细胞数。

1.5数据统计

数据用SPSS18软件包进行单因素方差分析(One Way ANOVA)，以“均值±标准差(Mean±SD)”表示，P<0.01为差异极显著。

2结果

2.1炔雌醚对睾丸组织结构的影响

如图1和表1显示，与对照组相比，0.01、0.10 mg·kg-1炔雌醚组睾丸组织结构无明显变化；曲细精管生精上皮充实，各级生精细胞数量多，排列整齐，紧密有序，管腔内有大量精子。1.00 mg·kg-1炔雌醚处理后，大鼠睾丸有一定程度的萎缩，但无统计学差异；较多曲细精管生精上皮生精细胞数量明显下降，排列松散而紊乱，管腔内没有或少见成熟的精子。

2.2炔雌醚对生精细胞增殖与凋亡的影响

如图2和表1所示，PCNA表达呈棕黄色，分布在多种生精细胞的细胞核内。与对照组相比，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚组PCNA阳性细胞数量无显著变化。1.00 mg·kg-1炔雌醚组PCNA阳性细胞数量下降49.35%，差异极显著(P<0.01)。TUNEL表达呈棕黄色，分布在凋亡生精细胞的细胞核内。对照组和0.01 mg·kg-1组TUNEL表达细胞数量较少，0.10 mg·kg-1组TUNEL表达细胞数量有增加趋势，但不显著。1.00 mg·kg-1炔雌醚组TUNEL阳性细胞数量显著增加了120.68%(P<0.01)。

表1炔雌醚对大鼠睾丸重量、生精细胞增殖与凋亡的影响

Table 1Effects of quinestrol on weight of testes，proliferation and apoptosis of spermatogenic cell in rats

**P<0.01表示与对照组相比差异极显著，下同。生精细胞的精原细胞、精母细胞、精子细胞和间质细胞的PCNA和TUNEL阳性细胞通过睾丸免疫组化切片的1 000个细胞进行统计

**P<0.01 compared with the control andP<0.01 were considered statistically significant.The same as below.The numbers of cells positive for PCNA and TUNEL were determined by counting 1 000 spermatogenic cells (spermatogonia，spermatocytes，sperm cells and Leydig cells) from ST cross-sections with immunohistochemistry staining

2.3炔雌醚对大鼠睾丸生精细胞p-ERK、p-JNK和p-P38 表达的影响

图3和表2表明，在对照组、0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚组，磷酸化ERK(p-ERK)主要表达在精原细胞的细胞质和细胞核。与对照组相比，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚组p-ERK表达细胞数量无显著变化。1.00 mg·kg-1炔雌醚组p-ERK表达在精原细胞、精母细胞、精子细胞和间质细胞的细胞核。细胞数量下降了54.7%(P<0.01)。与对照组相比，各试验组p-JNK表达在精原细胞的细胞核，呈增加趋势，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚组无统计学差异(P>0.05)。1.00 mg·kg-1炔雌醚组p-JNK在精原细胞、精母细胞、精子细胞和间质细胞的细胞核均有表达，表达细胞数量增加了44.74%(P<0.01)。与对照组相比，各试验组p-P38表达呈增加趋势，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚组主要表达在细胞核，增加数量无统计学差异(P>0.05)。1.00 mg·kg-1炔雌醚组p-JNK在精原细胞、精母细胞、精子细胞和间质细胞的细胞核均有表达，表达细胞数量增加了81.6%(P<0.01)。

表2炔雌醚对大鼠睾丸生精细胞p-ERK、p-JNK和p-P38 表达的影响

Table 2Effects of quinestrol on p-ERK，p-JNK and p-P38 of spermatogenic cell in rats

生精细胞的精原细胞、精母细胞、精子细胞和间质细胞的p-ERK，p-JNK和p-P38 阳性表达通过在睾丸免疫组化切片的计数1 000个生精细胞中的阳性细胞数进行统计

The numbers of cells positive for p-ERK，p-JNK and p-P38 were determined by counting 1 000 spermatogenic cells (spermatogonia，spermatocytes，sperm cells and Leydig cells) from ST cross-sections with immunohistochemistry staining

3讨论

化学合成药物炔雌醚作为啮齿类动物不育剂，广泛地用于控制鼠类种群数量[11-12]。炔雌醚通过诱导氧化应激、抑制生精细胞增殖、促进凋亡蛋白表达及抑制生殖激素分泌等途径抑制雄性生殖器官睾丸、附睾、精囊腺及前列腺发育，降低雄性生殖功能[13]。但是，环境内分泌干扰物造成雄性动物生殖疾病的分子机制仍有待于进一步探讨。MAPKs信号转导通路在正常的生理和疾病过程中均发挥重要的作用，短暂激活的ERKs促进细胞生存和增殖，持续的激活ERKs促进细胞的分化；而JNKs短暂激活促进细胞增殖和分化，持续的激活通过促进 P53、Bax、Fasl、TNF 及caspase-3等促凋亡蛋白的表达，促进细胞凋亡；P38通过激活下游分子原癌基因c-myc表达、磷酸化 P53参与 Fas/Fasl 介导的凋亡、激活 c-jun 和 c-fos表达，诱导 Bax 转位以及增强 TNF-α表达等多种途径促进细胞死亡。而且，MAPK通路中的3个成员ERK1/2、JNK和 P38通路均参与调节包括睾酮和雌二醇在内的多种生殖激素合成[14-16]，而激素合成在生精细胞的发育与增殖过程中发挥关键的作用，因此，MAPK通路可能与激素水平异常造成的生殖疾病密切相关。

本研究结果显示，7 d连续炔雌醚暴露造成大鼠睾丸组织结构紊乱，表达PCNA的生精细胞数量减少；同时，表达磷酸化ERK蛋白的生精细胞数量明显下降。B.Wang等[17]发现，HSP90抑制剂17-去甲氧基-17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG)通过抑制ERK，增强棉酚对Bcl-2表达的抑制。前期研究发现炔雌醚处理抑制生精细胞Bcl-2的表达，而ERK磷酸化的抑制可下调Bcl-2的表达，表明炔雌醚可能通过抑制ERK的磷酸化减少细胞增殖[10，18]。柳海燕等[19]通过激活ERK MAPK途径来调节3B-羟基类固醇脱氢酶(3B-HSD)，进而促进睾酮的合成。A.Santillo等[20]采用D-天冬氨酸激活大鼠精原细胞ERK磷酸化，上调雄激素受体表达，促进睾酮合成与分泌。前期研究发现，炔雌醚处理造成睾丸睾酮激素分泌的下降，因此，炔雌醚很可能通过抑制ERK MAPK途径阻碍睾丸睾酮激素的分泌，而睾酮的下降又进一步影响性激素依赖的睾丸、附睾、精囊腺及前列腺发育，并促进生精细胞的凋亡。与PCNA表达相反，TUNEL阳性细胞数量显著增加；同时，与ERK的磷酸化下降不同，JNK与P38的磷酸化均显著升高。前期研究发现炔雌醚促进Bax、Fas/FasL及P53的表达，表明炔雌醚通过激活JNK与P38的磷酸化促进凋亡蛋白表达，诱导生精细胞凋亡。J.Liu等[21]发现，棕榈酸通过激活ROS氧化应激、JNK及P38 MAPK信号通路促进心肌细胞自噬和凋亡。S.Qi等[22]研究证实，双酚A通过激活JNK和P38 MPAK信号通路，激活Fas/FasL系统促进睾丸支持细胞的凋亡。因此，炔雌醚通过直接抑制ERK MAPK途径、激活JNK和P38 MAPK途径抑制细胞增殖、促进细胞凋亡；而睾酮含量下降又间接抑制睾丸发育，最终促进生精细胞的凋亡。

综上表明，本研究通过炔雌醚处理大鼠试验探讨炔雌醚对睾丸MAPK信号通路的作用，初步论证MAPK在大鼠睾丸生精细胞凋亡中的作用。首次发现炔雌醚通过抑制ERK磷酸化降低PCNA的表达，从而抑制生精细胞增殖；并通过激活JNK和P38磷酸化增加TUNEL的表达，从而促进生精细胞凋亡。对生殖系统的MAPK信号通路进行深入的研究，有利于揭示生殖系统疾病的深层病理机制，从而为其防治寻找新的治疗途径提供参考。

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(编辑程金华)

The Role of MAPK Signaling Pathway in Quinestrol-induced Apoptosis of Spermatogenic Cells in Rat

LI Jian1*，CHEN Yao-xing2，CHEN Fu-ning3，WANG Zi-xu2，CAO Jing2，DONG Yu-lan2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；2.LaboratoryofVeterinaryAnatomy，CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；3.ChangpingHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine，Changping，Beijing102208，China)

Key words:MAPK signaling pathway；PCNA；quinestrol；spermatogenic cells；apoptosis

Abstract:This experiment was conducted to study the role of MAPK signaling pathway in quinestrol-induced apoptosis of spermatogenic cells in rat.Twenty 8-week-old male SD rats were randomly divided into 4 groups and were treated by using daily intraperitoneal injection of 0.00，0.01，0.10 and 1.00 mg·kg-1of BW quinestrol dissolved in olive oil for 1 week after 1-week adaptive feeding.At the end of the treatment，the testis tissue sections were prepared and the morphology of the testis tissue was observed by HE staining.The immunohistochemistry staining was performed to measure the expression levels of PCNA，MAPK signaling pathway of p-ERK，p-JNK and p-P38 in spermatogenic cells and TUNEL method was used to detect apoptosis of spermatogenic cells.The results showed that the epithelial thickness of rat seminiferous tube decreased as well as the number of spermatogenic cells decreased.Numerous spermatocytes and spermatids showed swelling or shrinkage and meanwhile the number of mature sperm reduced in the lumen after quinestrol exposure.The expressions of PCNA and p-ERK in the spermatogenic cells were significantly decreased.In contrast，the expressions of TUNEL，p-JNK protein and p-P38 protein were significantly increased.The results suggest that quinestrol exposure inhibited the development of rat testis by inhibiting proliferation and promoting MAPK-mediated apoptosis of spermatogenic cells.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.023

收稿日期：2015-09-08

基金项目：河南省教育厅高等学校重点科研项目基础研究计划(16A230004)；河南科技大学青年科学基金项目(2015QN032)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201310464065)

作者简介：李健(1980-)，男，安徽亳州人，博士，副教授，主要从事生殖毒理学、动物解剖学与组织胚胎学教学与研究 *通信作者：李健，E-mail：lijian800702@126.com

中图分类号：S865.1+2.3

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0381-07