复方中药对猪嗜血支原体感染预防作用的研究

董耀泽，李晓云，张晋强，石泽宇，陈建闪，李宏全，马海利

(山西农业大学动物科技学院，太谷 030801)



复方中药对猪嗜血支原体感染预防作用的研究

董耀泽，李晓云，张晋强，石泽宇，陈建闪，李宏全，马海利*

(山西农业大学动物科技学院，太谷 030801)

摘要：为研究复方中药对猪嗜血支原体(M.suis)感染的预防效果，将复方中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和强力霉素分别与M.suis阳性血液在细胞培养液中进行培养，间隔12 h用qPCR检测培养物中M.suis拷贝数。选取临床健康的35日龄仔猪进行M.suisPCR检测，将50头M.suisPCR阳性仔猪随机分为5组，每组10头，每组隔离饲养。三个复方中药组采用拌料方式连续喂服7 d，强力霉素组拌料喂服5 d，对照组饲料中不添加任何药物。分别于用药前、用药后第10、20、30天前腔静脉采血，对血液M.suis拷贝数、红细胞SOD活力、红细胞膜ATP酶(Na+K+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase)活力、淋巴细胞(T、B)增殖率、血清IgG含量进行检测。结果显示，三种复方中药在体外培养时均可极显著降低培养物中M.suis拷贝数(P<0.01)；在仔猪预防试验中，与对照组和强力霉素组相比，复方中药Ⅰ可以极显著降低血液中M.suis拷贝数(P<0.01)，提高红细胞SOD活力与B淋巴细胞增殖率(P<0.05或P<0.01)；复方中药Ⅱ可以提高红细胞SOD活力、Na+K+-ATPase活力与淋巴细胞增殖率(P<0.05)，但无法长时间抑制M.suis生长；复方中药Ⅲ可以极显著降低血液中M.suis拷贝数(P<0.01)，显著提高红细胞SOD活力(P<0.05)。结果说明：复方中药Ⅰ对M.suis自然感染有良好的预防作用。

关键词：猪嗜血支原体；复方中药；仔猪；预防

猪嗜血支原体(Mycoplasmasuis，M.suis)是一种寄生于猪红细胞表面、血浆及骨髓内的微生物。猪感染M.suis后，多数情况下不表现临床症状，呈隐性感染；当机体抵抗力降低或严重感染时，可使红细胞变形、裂解，引起猪发生以贫血、黄疸、发热等为主要症状的疾病，称为猪附红细胞体病(Eperythrozoonosis)[1-2]。M.suis感染及引起的猪附红细胞体病在许多国家和地区均有报道，给养猪业造成巨大经济损失。

目前，尚没有预防猪附红细胞体病的疫苗，对该病的预防和控制主要使用强力霉素、四环素、土霉素等抗生素类药物。但猪感染M.suis或患病后，由于并发或继发的病原体不同，临床用药效果亦有差异，不仅导致了M.suis的耐药性，且易引起药物残留和影响食品安全。因此，需要研究有效预防M.suis感染的中药制剂。

与西药相比，中药制剂不易产生耐药性，价格低廉，且毒副作用小。猪附红细胞体病属温热症，且热势偏盛，故本研究选取具有抗菌或抗病毒、清热解毒、解表凉血、滋阴壮阳等作用的中药，按照“君臣佐使”原则设计三种复方中药，将其添加于M.suis隐性感染仔猪的基础日粮中，检测其预防效果，为临床上合理选择预防M.suis感染药物提供依据。

1材料与方法

1.1复方中药组成及原则

选择具有杀菌或抗病毒作用的中药和清热解毒、解表凉血、滋阴壮阳的中药，按照“君臣佐使”的原则设计复方中药。

复方中药Ⅰ：由黄芩、黄柏、黄连、大黄等组成。以清三焦湿热、解气分血分之湿毒为原则。

复方中药Ⅱ：由苦参、茵陈、砂仁、青蒿等组成。以清湿热毒、散气分结、健脾截疟为原则。

复方中药Ⅲ：由柴胡、丹皮、黄芪、黄连等组成。以补气凉血、表里双解湿毒为原则。

1.2动物选择及分组处理

于山西某养殖场随机选取100头35日龄健康仔猪，于前腔静脉无菌采EDTA抗凝血液2 mL，进行PCR检测[3]，筛选出50头M.suis自然感染仔猪，随机分为5组，每组10头，在相同条件下进行隔离饲养，其中复方中药Ⅰ、复方中药Ⅱ、复方中药Ⅲ组采用拌料方式(药物含量为2%)连续服用7 d，强力霉素组拌料(药物含量为0.02%)服用5 d，对照组喂服无任何药物的饲料。于喂服药物前1天和喂服药物后第10、20、30天分别进行无菌采血，每次前腔静脉采EDTA抗凝血7 mL和非抗凝血2 mL。

1.3试验方法

1.3.1M.suisDNA重组质粒qPCR定量标准曲线建立参考A.M.Guimaraes等[4]文献设计M.suis扩增引物，上游引物F：5′-TGATGGGTAGCTGGACTGA-3′，下游引物R：5′-GCTCCATCAGACTTTCGTC-3′，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，预计扩增M.suisDNA的片段大小为157 bp。使用Omega试剂盒提取M.suis阳性血液DNA，进行普通PCR。将普通PCR扩增片段回收作为目的基因，与pEASY-T3质粒载体连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑选阳性克隆细胞增菌培养，使用Omega质粒纯化试剂盒提取重组质粒DNA，用核酸蛋白检测仪测定其浓度，将其换算为M.suis拷贝数，作为检测M.suis拷贝数的重组质粒标准品。将标准品10倍递倍稀释，按照QuantiFast®SYBR Green PCR Kit说明进行qPCR，制作M.suisDNA重组质粒绝对定量标准曲线。1.3.2药物对M.suis体外抑制试验将三种复方中药分别用水煮法熬制，用40%血清培养基配制成一定浓度。在24孔细胞培养板各孔中加入M.suis阳性抗凝血300 μL和含药物的培养基1 700 μL，使复方中药Ⅰ、复方中药Ⅱ、复方中药Ⅲ、强力霉素含量达4 000 μg·mL-1，对照孔加不含药物的培养基。将培养板置37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，分别于0、12、24、36、48和60 h各吸取3孔培养物，用Omega试剂盒提取培养物DNA，进行qPCR检测。依据M.suisDNA重组质粒标准曲线，计算培养物中M.suis拷贝数。

1.3.3猪血液中M.suisqPCR检测将采集的血液样品，提取DNA，100 μL dH2O洗脱DNA。取2 μL基因组DNA作为扩增模板，进行qPCR扩增，依据M.suisDNA重组质粒标准曲线，计算血液中M.suis拷贝数。

1.3.4红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力测定按照SOD测定试剂盒说明(南京建成)进行测定。

1.3.5红细胞膜ATP酶活力测定按照超微量ATP酶(Na+K+-ATPase，Ca2+Mg2+-ATPase)测定试剂盒说明(南京建成)进行测定。

1.3.6淋巴细胞增殖能力测定在离心管中加入3 mL猪外周血液淋巴细胞分离液，沿管壁缓慢加入2 mL抗凝血。2 000 r·min-1，离心20 min。吸出白膜层(淋巴细胞)，洗涤3次，弃去上清。加入含15%胎牛血清的RPMI-1640重悬细胞，吹打均匀后取样，用台盼蓝染色计数活细胞数(>95%)，调整细胞浓度至1×106·mL-1，加入96孔细胞培养板中，每个样品设非特异性刺激ConA(5 μg·mL-1)、LPS(10 μg·mL-1)和不加刺激物(RPMI-1640)孔，每个样品设4个复孔。将培养板置于5% CO2培养箱，37 °C培养48 h。在培养结束前4 h，每孔加入MTT(5 mg·mL-1)，培养结束后每孔加入DMSO，充分溶解。用酶标仪在570 nm波长下测定OD值。淋巴细胞增殖能力用刺激指数(SI)表示。

SI=刺激孔OD值/对照孔OD值

1.3.7血清IgG含量测定采用猪免疫球蛋白G(IgG)酶联免疫检测试剂盒(南京建成)进行测定。

2结果

2.1M.suisDNA重组质粒qPCR定量标准曲线

由质粒标准品的Real-time PCR扩增标准曲线(图1)可知曲线具有良好的线性关系，标准曲线的r2为0.997，E为102.5%，符合扩增动力学的要求(r2>0.98趋近于1；0.9

2.2药物体外M.suis感染抑制试验结果

将药物与M.suis作用不同时间后的培养物提取DNA，进行qPCR检测，依据重组质粒标准曲线，计算培养物中M.suis拷贝数(图2)。结果显示，阴性对照组在检测时间中M.suis拷贝数没有明显变化；三种复方中药和强力霉素均随着药物与M.suis作用时间的延长，M.suis拷贝数不断减少，说明所用药物在体外对M.suis均有一定的抑制或杀灭作用。其抑制或杀灭程度依次为复方Ⅰ>强力霉素>复方Ⅱ>复方Ⅲ。

2.3药物对血液中M.suis拷贝数的影响

根据血液M.suisqPCR检测结果，参照重组质粒标准曲线，计算血液M.suis的拷贝数(图3)。由于随机分组时各组中每头仔猪血液M.suis感染率差异较大，导致用药前后各组所测血液M.suis拷贝数误差较大，但用药前后每头仔猪血液M.suis拷贝数的变化趋势基本一致。对照组血液M.suis拷贝数在检测期间基本没有变化，用药组在给药后第10天检测时，血液中M.suis几乎检测不到，在给药后第30天检测时，复方中药Ⅰ、复方中药Ⅲ、强力霉素组数值略有上升，但上升幅度较小，与用药前相比，差异均极显著(P<0.01)，但复方中药Ⅱ组在给药后第30天检测时，血液中M.suis拷贝数恢复至用药前。2.4药物对红细胞SOD活力影响

在检测期间，随着用药后时间的延长，对照组红细胞SOD活力值(图4)呈现下降趋势(P>0.05)，复方中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组红细胞SOD活力值显著增加(P<0.05或P<0.01)；强力霉素组红细胞SOD活力值仅呈现上升趋势(P>0.05)。

2.5药物对红细胞膜ATP酶活力影响

对照组红细胞膜ATPase活力值(图5、图6)随时间的增加呈现下降趋势，其中Ca2+Mg2+-ATPase活力值显著下降(P<0.05)。复方中药Ⅰ、复方中药Ⅱ、强力霉素组Na+K+-ATPase活力值呈现持续上升，其中强力霉素组极显著增加(P<0.01)，复方中药Ⅱ组显著增加(P<0.05)，复方中药Ⅰ组仅有上升趋势(P>0.05)；复方中药Ⅲ组Na+K+-ATPase活力值出现了一过性上升，于给药后第10天极显著增加(P<0.01)，但在给药后第20天检测时又开始显著下降，第30天检测时恢复到了给药前的水平。复方中药Ⅰ、Ⅱ组Ca2+Mg2+-ATPase活力值呈现上升趋势(P>0.05)，复方中药Ⅲ、强力霉素组活力值分别于给药后第10、20天呈现上升，第30天酶活力值又恢复至给药前的水平。

2.6药物对淋巴细胞增殖能力的影响

在检测期间，对照组T、B淋巴细胞刺激指数(图7、图8)无明显变化，复方中药Ⅰ、Ⅱ组T、B淋巴细胞刺激指数呈明显上升(P<0.05或P<0.01)，复方中药Ⅲ、强力霉素组T、B淋巴细胞刺激指数先上升后又下降。

2.7药物对血清IgG含量的影响

对照组血清IgG含量(图9)无明显变化，用药组在用药后血清IgG含量均有所上升，其中复方中药Ⅰ组在用药后第10天血清含量显著上升(P<0.05)，复方中药Ⅱ组在用药后第20天血清含量极显著上升(P<0.01)，复方中药Ⅲ组和强力霉素组在用药后第10天血清含量极显著上升(P<0.01)；但在给药后第30天时IgG含量下降，复方中药Ⅰ、复方中药Ⅱ、强力霉素3组IgG含量均高于用药前(P>0.05)，复方中药Ⅲ组却低于用药前(P>0.05)。

3讨论

3.1药物体外对M.suis拷贝数的影响

在体外研究药物与M.suis作用后，M.suis拷贝数的变化可以直观的反映药物对M.suis的作用效果。本研究将药物与M.suis在细胞培养液中作用不同时间后，用qPCR定量测定M.suis拷贝数，结果说明，复方中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与强力霉素有同样的药效，随着作用时间的延长M.suis拷贝数逐渐降低，说明药物在体外可以有效地抑制或杀灭M.suis。

3.2药物对猪血液中M.suis拷贝数的影响

仔猪用药后，血液中M.suis拷贝数检测结果表明，复方中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与强力霉素可以有效地降低M.suis拷贝数，但停药后随着时间延长，M.suis拷贝数不断增加，尤其是复方中药Ⅱ在停药20 d左右M.suis拷贝数又恢复到原来水平，这说明所用复方中药均有杀灭或抑制M.suis作用，停止用药后，由于血药浓度的降低，M.suis又开始增殖，使血液中M.suis数量不断增加。

3.3药物对红细胞相关指标的影响

M.suis主要致病机制是M.suis附着于红细胞，使红细胞膜发生变形，通透性增加，易发生溶血；同时，M.suis改变红细胞膜抗原性，被自身免疫系统视为异物，从而使宿主通过启动自身免疫防御机制破坏红细胞[5]。所以，本研究通过检测红细胞相关指标变化说明复方中药对M.suis感染的预防作用。

3.3.1红细胞SOD红细胞SOD主要作用是通过催化阴离子自由基发生岐化反应生成二氧化碳和水，消除自由基，从而阻止自由基的链锁反应，是防止红细胞损伤的重要原因，在清除红细胞表面黏附的抗原抗体复合物和血液病原过程中起重要作用。李清艳等[6]、韩惠瑛等[7]、马海利等[8]研究证实M.suis自然感染仔猪红细胞SOD活力降低。本研究所用复方中药均可增强红细胞SOD活性，提高红细胞清除自由基的能力，平衡机体的氧化与抗氧化能力。

3.3.2红细胞Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPaseATPase在细胞的物质转运、能量代谢、维持细胞内外正常离子浓度等方面起着重要作用，机体在缺氧及一些疾病状态下，ATPase活力会发生一系列改变，马海利等[8]证实红细胞ATPase活力随着M.suis感染强度的增加而降低。本研究证实所用复方中药均可提高红细胞膜Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活力，对细胞膜内外紊乱的离子起到良好的调节作用。

3.4药物对免疫功能的影响

柴方红等[9]、J.F.Zachary等[10]证明仔猪感染M.suis或患附红细胞体病后，体液免疫水平和细胞免疫水平均明显下降。本研究通过检测T淋巴细胞增殖率、B淋巴细胞增殖率、血清IgG含量变化，从细胞免疫与体液免疫方面说明复方中药对M.suis感染的预防作用。

淋巴细胞转化能力的高低可反映机体的免疫功能状态，常用淋巴细胞增殖率反应机体免疫能力[11-12]。本研究证明，复方中药均可使T、B淋巴细胞增殖率升高，尤其是复方中药Ⅰ与复方中药Ⅱ能够显著提高淋巴细胞增殖率，说明复方中药可以提高仔猪的细胞免疫功能。IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，其含量高低可以反映机体的防御能力。已证明复方制剂可以刺激机体产生免疫球蛋白[13-14]，本研究证明复方中药可以使血清中IgG含量也出现了一过性增长，说明复方中药可以通过提高机体免疫力，对抑制M.suis感染起到了一定的作用。

4结论

三种复方中药在体外均有抑制或杀灭M.suis的作用；复方中药Ⅰ可以显著降低血液中M.suis拷贝数，提高红细胞SOD活力与B淋巴细胞增殖率；复方中药Ⅱ无法长时间抑制血液中M.suis生长，但可以提高红细胞SOD活力、Na+K+-ATPase活力与淋巴细胞增殖率；复方中药Ⅲ可以显著降低血液中M.suis拷贝数，提高红细胞SOD活性。结果说明，复方中药Ⅰ对M.suis自然感染有良好的预防作用。

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(编辑白永平)

Prophylactic Effect of Compound Chinese Herbal Medicine onMycoplasmasuisInfection

DONG Yao-ze，LI Xiao-yun，ZHANG Jin-qiang，SHI Ze-yu，CHEN Jian-shan，LI Hong-quan，MA Hai-li*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Key words:Mycomplasmasuis；compound Chinese herbal medicine；piglets；prophylactic effects

Abstract:The study aimed to develop compound Chinese herbal medicine that is more efficient in prevention and control of theM.suisinfection.M.suisof positive blood were cultured in cell culture fluid with the compound Chinese herbal medicine Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ and deoxytetracycline.The copies ofM.suisin cell culture fluid were measured by qPCR every 12 h.Fifty clinical healthy，35 day-old piglets with natural infection ofM.suisconfirmed by PCR were randomly allocated to 5 groups，each with 10 replicates，and all the groups were fed separately.Piglets in three compound Chinese herbal medicine group were fed with a diet that contained 20 g·kg-1of the compound Chinese herbal medicine Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲ respectively for seven days；piglets in deoxytetracycline group were fed with a diet that mixed 200 mg·kg-1of deoxytetracycline for five days；piglets in control group were fed with diet.Blood samples of piglets were collected by the anterior vena before (0 day) and after the usage of medicine at the 10th，20thand 30thdays.The copies ofM.suisin blood，erythrocyte superoxide dismutase，erythrocyte membrane ATPase (Na+K+-ATPase，Ca2+Mg2+-ATPase)，lymphocyte proliferation rate (T，B)，and the serum content of IgG were measured.The results showed that：the three compound Chinese herbal medicine could significantly decrease the copies ofM.suisinvitro(P<0.01)；compared with the deoxytetracycline group and the control group，the compound Chinese herbal medicine Ⅰ could significantly decrease the copies ofM.suisin blood of piglets (P<0.01)，improve the activity of erythrocyte superoxide dismutase and B-proliferation rate (P<0.05)；the compound Chinese herbal medicine Ⅱ had positive effects on erythrocyte superoxide dismutase，the activity of erythrocyte membrane Na+K+-ATPase and lymphocyte proliferation rate (P<0.05)，whereas it could not effectively reduce theM.suiscopies；the compound Chinese medicine Ⅲ could reduce theM.suiscopies in blood of piglets (P<0.01) and only improve the activity of erythrocyte superoxide dismutase (P<0.05).In conclusion，the compound Chinese medicineⅠhas favorable prophylactic effects on theM.suisinfection.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.026

收稿日期：2015-07-13

基金项目：山西省科技攻关项目(20130311028-1)

作者简介：董耀泽(1989-)，男，山西太原人，硕士，主要从事动物传染病的诊断与防治的研究，E-mail：t123o456m789@163.com *通信作者：马海利，教授，E-mail：mahaili1718@126.com

中图分类号：S852.62；S853.9

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0404-07