禽网状内皮组织增生病病毒感染对SPF鸡免疫器官和疫苗免疫效果的影响

李　凯，高　立，祁小乐，高宏雷，高玉龙，王永强，王笑梅

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，禽免疫抑制病研究团队，哈尔滨 150001)



禽网状内皮组织增生病病毒感染对SPF鸡免疫器官和疫苗免疫效果的影响

李凯，高立，祁小乐，高宏雷，高玉龙，王永强，王笑梅*

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，禽免疫抑制病研究团队，哈尔滨 150001)

摘要：禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类的一种重要免疫抑制性疾病，目前对其造成免疫抑制的机制尚不十分清楚。本研究对实验室分离的一株REV流行毒株(HLJR0901株)感染1日龄SPF鸡后对感染鸡免疫器官和免疫功能造成的影响进行研究。结果表明，1日龄SPF鸡感染REV后出现生长迟缓，法氏囊、胸腺萎缩，脾肿大的症状。感染鸡出现法氏囊滤泡淋巴细胞大量坏死减少，间质结缔组织增生；胸腺出血，胸腺小体增多；脾小结明显萎缩，淋巴细胞减少等病理变化。荧光定量PCR检测发现，病毒在感染鸡法氏囊、胸腺和脾内均有分布，且持续存在。SPF鸡感染REV后出现严重的免疫抑制，使AIV灭活疫苗和NDV弱毒疫苗的免疫效果显著下降。本研究为阐明REV的免疫抑制机制提供了重要的实验数据。

关键词：禽网状内皮组织增生病；致病性；免疫器官；免疫抑制

网状内皮组织增生病(reticuloendotheliosis，RE)是由网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)群的反转录病毒引起的鸡、鸭、火鸡和其他禽类的一群病理综合征[1-2]。近年来，REV已在全球范围内流行，国内鸡群中REV的感染也非常严重，分布日益广泛[3-5]。其中，在出现免疫抑制状态的鸡群REV的检出率要比正常鸡群高很多。本实验室在之前研究中成功在黑龙江省分离到一株REV流行毒株——HLJR0901株[6]。该毒株除与中国早期分离株HA9901亲缘关系较远外，与中国其他分离株、美国分离株以及从污染疫苗中分离的REV毒株均具有很高的同源性[7]。本研究对1日龄SPF鸡以不同剂量人工感染REV(HLJR0901株)，通过对感染鸡生长发育、免疫器官、免疫功能以及体内病毒分布进行检测，系统分析了REV早期感染造成的影响，为REV引起的免疫抑制机制的研究提供了重要的数据。

1材料与方法

1.1菌株和实验动物

REV HLJR0901株由本实验室分离鉴定；SPF鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2主要试剂

Hot Start ExTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，组织DNA提取试剂盒购自Omega公司，引物和探针由Invitrogen公司合成。

1.3REV感染试验

取1日龄SPF鸡120只，分为3组，每组40只。组1攻毒REV HLJR0901株102TCID50·只-1，组2攻毒REV HLJR0901株104TCID50·只-1，组3为PBS对照组。攻毒途径为腹腔注射，0.1 mL·只-1。试验前采血检测REV抗体滴度。攻毒后每周每组取5只鸡，称重，剖检并采集法氏囊、胸腺、脾，称取各器官重量，计算器官指数。器官体重比=(器官重量/体重)×1 000；器官指数=试验组鸡的器官体重比/对照组鸡器官体重比的平均值。当器官指数≥1.3时判为该器官肿大，器官指数≤0.7时判为萎缩，0.7<器官指数<1.3时判为此器官无明显变化。采集的各器官分为两部分，一部分用于检测病理变化，另一部分保存于-70 ℃，用于DNA提取和病毒载量检测。

1.4免疫抑制试验

取1日龄SPF鸡60只，分为3组，每组20只。组1攻毒REV HLJR0901株102TCID50·只-1，组2攻毒REV HLJR0901株104TCID50·只-1，组3为PBS对照组。攻毒后感染鸡分别于7日龄、21日龄免疫NDV LaSota弱毒疫苗(购自哈尔滨维科公司)，于14日龄免疫AIV H5灭活疫苗(购自哈尔滨维科公司)，根据说明书剂量和操作进行。免疫后各周采血，检测NDV和AIV HI抗体效价，直到免疫后8周。

1.5病理变化

采集的各组织经固定和石蜡包埋后制作病理切片，HE染色镜检，观察组织病理学变化。根据各器官病理变化的不同程度，对其进行组织病理学打分：0，没有任何病变；1，散在的或部分滤泡病变；2，小于或等于25%的细胞发生病变；3，小于或等于50%的细胞发生病变；4，50%～75%的细胞发生病变；5，75%～100%的细胞发生病变。每周对每个试验组采集的5只试验鸡的法氏囊、胸腺、脾分别制备切片观察、打分，最后统计每周各器官病变的平均值。

1.6病毒载量测定

提取组织DNA，用本实验室建立的Real-time PCR方法检测各试验组鸡各器官的病毒载量[8]。对于每一份提取DNA样品，同时检测gp90目的基因和β-actin内参基因的拷贝数，所得结果换算为每克组织中所含有的病毒载量。

1.7统计学分析

2结果

2.1REV感染对SPF鸡体重和器官指数的影响

1日龄SPF鸡感染REV后，从第2周开始表现生长迟缓的症状，而且日趋明显，与对照组相比差异显著(P<0.05)；104TCID50感染组鸡在第4、6、7、8周体重均低于102TCID50感染组，差异显著(P<0.05)。与对照组相比，感染鸡从第2周开始法氏囊出现明显萎缩，104TCID50感染组自第5周开始法氏囊指数显著低于102TCID50感染组(P<0.05)。胸腺于感染后1周出现肿大症状，第2周开始呈现明显萎缩(P<0.05)，104TCID50组自第6周开始胸腺指数显著低于102TCID50组(P<0.05)。脾于感染后第2周开始出现肿大症状(P<0.05)，不同剂量组之间差异不显著(P>0.05)(图1)。

2.2REV感染对SPF鸡的病理损伤

如图2所示，102TCID50感染组法氏囊实质内淋巴细胞出现轻度减少；胸腺局部出血、轻度淤血、髓质内的胸腺小体扩张、内有均质嗜酸性染色的崩解产物(箭头所示)；脾无明显病理变化。法氏囊较严重病变出现在感染4周以后，胸腺的严重病变出现在感染6周以后(表1)。对104TCID50剂量组的病理学检测发现，法氏囊部分滤泡的淋巴细胞大量坏死、减少，间质结缔组织增生；胸腺出现局部出血，轻度淤血，胸腺小体增多(箭头所示)；脾内脾小结明显萎缩，淋巴细胞减少。法氏囊和胸腺的严重病变分别出现在感染后4周和5周之后。

表1感染REV的SPF鸡免疫器官病变打分

Table 1Pathological score of immune organs from the chickens infected with REV

2.3REV感染SPF鸡后各免疫器官的病毒载量

1日龄SPF鸡感染不同剂量REV后，从第1周开始即可在法氏囊、胸腺和脾内检测到病毒，不同组织的病毒载量在各时间点无显著差异(P>0.05)(图3)。感染后1周，102和104TCID50试验组的组织平均病毒载量分别为106.82copies·g-1和108.54copies·g-1，差异显著(P<0.05)；从感染后2周至试验结束，两感染剂量组的病毒载量差异不显著(P>0.05)。

2.4REV感染对NDV和AIV疫苗免疫效果的影响

1日龄SPF鸡感染REV后，对感染鸡免疫NDV LaSota弱毒疫苗和AIV H5灭活疫苗，免疫后检测HI抗体滴度。从图4可以看出，NDV弱毒疫苗免疫后1周，两个REV感染组的NDV HI抗体滴度就显著低于未感染组(P<0.05)，随免疫后时间的延长，免疫抑制作用更为显著。AIV灭活疫苗免疫后2周，REV感染组的AIV抗体滴度显著低于未感染组(P<0.05)，两个感染组的免疫抑制状态一直持续至试验结束。104TCID50感染组与102TCID50感染组相比，NDV和AIV抗体滴度降低得更加明显(P<0.05)。

3讨论

REV是禽类除马立克病病毒、禽白血病病毒之外的第三种重要的致瘤性病毒，同时也是一种重要的禽免疫抑制性病毒[1]。世界上第一个REV分离株T株是1958年在英国分离达到的[1]。中国于1986年在南京分离到了第一株REV毒株C45株[9]。随后，REV在中国的分布日益广泛，呈现持续流行的趋势。目前该病已成世界性分布，在各大洲都有流行[1]。研究表明，马立克病病毒、鸡传染性贫血病毒和REV等免疫抑制性病毒在生产鸡群中的混合感染是导致当前养禽业免疫失败和生产性能下降的重要因素之一[10]。

免疫抑制是指由于各种因素作用，使机体对抗原的应答能力低下甚至丧失的现象[11]。REV本身对禽的致死力不明显，但其能够损害机体的免疫系统，使机体的免疫功能下降，从而易遭受其他病原的侵袭。当REV与其他病毒发生混合感染时，病毒间可相互发生作用，加重病情[12]。近年来，中国的鸡群为预防NDV和AIV的发生采取了非常强化的免疫程序，但是仍有少数鸡群发病，免疫失败的现象也时有发生，这在一定程度上是由于鸡群中免疫抑制性病毒的感染造成的。

REV是禽类的一种重要免疫抑制性病毒，目前对其造成免疫抑制的机制尚不十分清楚。研究发现，REV感染1日龄SPF鸡可以造成T、B淋巴细胞数目的显著下降[13]。本研究也表明，SPF鸡感染REV后两周开始，法氏囊和胸腺就开始呈现萎缩，脾呈现肿大症状，并可见淋巴细胞坏死减少等组织病理损伤。对REV-A和鸡合胞体病毒形成的嵌合病毒研究表明，REV-A的gag和env两个基因片段与其较强的免疫抑制能力有关[14]。感染REV-T株的鸡，其脾细胞对促有丝分裂原和植物血凝素的应答能力受到抑制，这种抑制与REV-A有关，而且是由抑制性细胞群所介导的[15]。

本研究结果表明，REV早期感染导致NDV弱毒疫苗和AIV灭活疫苗的免疫效果显著降低；感染鸡不仅平均抗体水平较低，而且个体间差异明显，个别鸡甚至检测不到抗体反应；而且这种免疫抑制状态可以持续存在，即使加强免疫也无法消除。对病毒载量的检测发现，REV感染1日龄SPF鸡后一周，就可以在其主要免疫器官中检测到大量的病毒，并可以持续存在，这可能是其造成持续的免疫抑制的原因之一。研究进一步表明，100个TCID50低剂量的REV感染就可以导致上述显著的免疫抑制，高剂量(104TCID50)REV感染造成的症状、病理损伤和免疫抑制现象更为显著。以上数据揭示了当前REV在现地的广泛流行可能是造成多种疫苗免疫失败的重要因素，从而表明中国鸡群中A类病毒性疾病的预防不仅需要改进这些病的疫苗和加强免疫程序，还需要进一步控制鸡群中免疫抑制性病毒的感染。同时，本研究也为进一步阐明REV的免疫抑制机制提供了重要的试验数据。

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(编辑白永平)

The Influence of Reticuloendotheliosis Virus Infection on Immune Organs and Immune Efficacy in SPF Chickens

LI Kai，GAO Li，QI Xiao-le，GAO Hong-lei，GAO Yu-long，WANG Yong-qiang，WANG Xiao-mei*

(PoultryImmunosuppressiveDiseaseTeam，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)

Key words:reticuloendotheliosis；pathogenicity；immune organs；immunosuppression

Abstract:Reticuloendotheliosis(RE) is an important avian immunosuppressive disease with the mechanism of the immunosuppression barely known.In this study，the influence of a REV strain，HLJR0901 isolated in our lab，infection on the immune organs and immunology competence in SFP chickens was examined.Decline in body weight，atrophy in bursa of Fabricius and thymus，and tumefaction in spleen were detected after REV infection.Histopathology study observed several pathological changes in the main immune organs，including the necrosis and number decline of the immune cells and the hyperplasia of the connective tissues in the bursa of Fabricius，the haemorrhagia and increasing of the thymic corpuscle in the thymus，and atrophy of the splenic follicle in the spleen.High proviral loads were detected in the bursa of Fabricius，thymus and spleen with a long persistence.Additionally，the antibody responses to AIV and NDV vaccines were significantly inhibited by REV early infection compared with the control chickens.This study provided important data for illuminating the mechanism of the REV-induced immunosuppression.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.017

收稿日期：2015-03-20

基金项目：国家国际科技合作专项项目(2011DFA32210)；农业科技成果转化资金项目(2013GB23260577)；国家现代农业产业技术体系(nycytx-42-G3-01)

作者简介：李凯(1986-)，男，山东泰安人，助理研究员，博士，主要从事动物病毒学研究，E-mail：likai01@caas.cn *通信作者：王笑梅，E-mail：xmw@hvri.ac.cn

中图分类号：S852.659.3

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0340-06