微小RNA与心肌纤维化关系的研究进展

曹帅 综述 魏玲，2 审校

(1.昆明医科大学研究生部，云南 昆明 650000；2.成都军区昆明总医院地方干部病房，云南 昆明 650000)



微小RNA与心肌纤维化关系的研究进展

曹帅1综述 魏玲1，2审校

(1.昆明医科大学研究生部，云南 昆明 650000；2.成都军区昆明总医院地方干部病房，云南 昆明 650000)

心肌纤维化是临床上多种心脏疾病共同经历的一种病理过程，对心脏细胞重构、心脏的电传导、心功能等都有很大的影响。微小RNA是一类由16～22个核苷酸分子组成的单链非编码核糖核酸片段，以调控基因表达的方式参与各种生理和病理过程。在心肌纤维化的病理发展过程里，很多种微小RNA被发现参与其中，并且在心肌纤维化过程中扮演重要的角色，有的起到促进心肌纤维化作用，有的则有抑制心肌纤维化的心肌保护作用。研究这些微小RNA和心肌纤维化之间的关系，可丰富临床对心肌纤维化的诊疗思路和途径。现对近年研究发现的一部分参与调节心肌纤维化的微小RNA做一综述。

心肌纤维化；微小RNA；机制

微小RNA(miRNAs)是一类由16～22个核苷酸分子组成的单链非编码核糖核酸片段。此类小分子RNA主要以结合各类mRNA的3’端非编码区(3’-UTR)发挥作用，在各类蛋白质的转录水平进行调控。miRNA可通过对心肌纤维化中基因的调控促进或者抑制心肌纤维化的发生发展过程。与心肌纤维化相关的miRNA不断被发现，提示miRNA将成为心肌纤维化发生的新的重要机制。

1 心肌纤维化及其机制

1.1 心肌纤维化概念

大多数心血管疾病，如高血压、冠心病、心律失常，甚至包括其他系统疾病如糖尿病心肌病等疾病发展到心力衰竭，都会经历心肌纤维化的过程。正常心肌胶原有5种，以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主，Ⅰ型胶原占心肌胶原蛋白的80%，其特点为纤维较粗，因其较大的僵硬度和很强的抗牵拉特性来维持心室壁强度。Ⅲ型胶原占11%，心室壁的弹性则由其纤维较细、弹性和伸展性好的特点决定。当心肌纤维化发生时，在正常心肌组织中成纤维细胞增殖，胶原纤维过量沉积，具体表现为胶原的质量浓度、容积分数显著异常，各类型的胶原纤维分布排列紊乱、比例失调。成纤维母细胞增殖并向肌成纤维细胞分化，胶原纤维合成分泌增多、降解减少，当胶原纤维异常增多，Ⅰ/Ⅲ型比例升高，势必会造成心室壁顺应性下降，舒张期功能受限，当心肌纤维化进一步加重，收缩功能也会受到影响，心脏射血功能下降，相应的冠状动脉血流则会下降。而当冠状动脉纤维化导致其管腔狭窄，会直接加重心肌供血不足。另外，心肌纤维化的心肌组织电传导异常，导致了心律失常的发生。

1.2 心肌纤维化机制

心肌纤维化机制目前尚不完全清楚，较为明确的有以下6种机制:转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor，CTGF )、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、炎症因子、缝隙连接蛋白、基质金属蛋白酶，其中最重要的是TGF-β1 。

TGF-β是转化生长因子家族成员，在哺乳动物中只发现了 TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 这 3 种形式[1]。TGF-β1是由 2条含有 112个氨基酸的多肽链单体借助二硫键相连组成的相对分子量为25 000的二聚体，在体细胞系中所占比例最高、活性最强、功能最多、分布最广泛。在调节细胞外基质代谢的细胞因子中，研究最多与细胞外基质积聚关系最为密切的是TGF-β。Smads蛋白家族则在哺乳动物细胞内充当 TGF-β信号的介导子，TGF-β主要通过TGF-β/Smad 途径发挥生物学效应。心肌梗死、压力负荷均能使TGF-β上调，并可观察到胶原蛋白、纤维连接素的持续表达；在心肌梗死瘢痕区Smad2、3、4的表达也增加；相反，有抑制作用的Smad7的表达则在心肌梗死瘢痕区表达减少[2]。动物实验[3]发现，TGF-β杂合子小鼠其心肌纤维化和TGF-β1均较野生型小鼠明显减少，而其生存率和心功能均较野生型对照组小鼠明显增加。TGF-β1 导致细胞外基质过度积聚的环节可总结为以下几点：(1)刺激细胞外基质产生细胞合成大量细胞外基质;(2)细胞外基质降解的减少是引起细胞外基质过度积聚的重要环节，TGF-β1 通过抑制细胞外基质降解酶的活性，从而减少细胞外基质的降解能力;(3) TGF-β1 能促进细胞外基质产生细胞表达α-平滑肌肌动蛋白，使其活化并发生表型转化，转变为肌成纤维细胞，后者能合并和分泌大量胶原等细胞外基质成分；(4) TGF-β1能增加细胞外基质的表达，促进细胞外基质与细胞黏附。虽然TGF-β1在各种纤维化疾病发生中起重要作用，但并不是孤立的，其他细胞因子如CTGF等也协同 TGF-β1 发挥作用[4]。

2 miRNAs概述

早在1993年，Lee等[5]在果蝇体内发现了第一个miRNA，命名为Lin-4，此后，miRNA逐渐成为生命科学界研究的焦点，对其形成、 作用机制和功能的研究很快全面开展起来。至2014年4月，Sanger研究所最新的miRNA数据库Release21.0已收录28 645种成熟miRNA(参见https://www.mirbase.org)。miRNA的基因有70%～90%位于基因组编码序列的基因间隔区，其余位于内含子序列，极少数存在于蛋白质编码区[6-7]。在细胞核内，miRNA通过RNA聚合酶Ⅱ转录而来，形成具有头部polyA帽结构和多聚腺苷酸尾巴的初级miRNA,再经RNA酶Ⅲ核酸内切酶(RNAaseⅢ)Drosha或Pasha与DGCR8形成的复合物剪切加工后形成70～100个碱基构成的茎环样结构，即前体miRNA。前体miRNA与输出蛋白exportin-5结合，转运到细胞质中。经RNA酶Ⅲ核酸内切酶Dice1剪切修饰，成为由18～23 bp的二聚体，最终经解螺旋酶打开二聚体，其中一条单链被降解，另一条即成熟的miRNA与argonaute蛋白以及Dicer结合形成经RNA诱导的沉默复合物，发挥生理作用。

最终成熟的miRNAs由平均16～22个核苷酸分子构成，可折叠成发卡状结构，5’端为磷酸基团，3’端为羟基，其5’端2～8个核酸序列具有保守性，称为种子序列(seed sequence)，据研究Lin-7在人类完全保守[8]。miRNAs的基因表达还具备基因簇集现象和时空特异性[9-10]。 这些特征正是miRNAs在生物体生长发育不同阶段和不同器官形成过程中发挥重要调节作用的功能基础 。

miRNA主要通过与mRNA 3’-UTR相互配对结合，在转录水平参与靶基因表达的调节。大多数情况下，一种miRNA可以针对多个mRNA进行负性调控使其抑制表达或降解，因此，很多转录子可能受到miRNA的精细调控，从而使miRNA可在基因的转录-翻译过程中起重要作用。大多数miRNA与靶mRNA结合后以降低其稳定性和抑制其翻译来表现调控作用，如果 miRNA与靶mRNA 完全匹配，则该复合体对靶mRNA起降解作用，此类调控见于植物体中；如果两者序列仅部分匹配，尤其是 miRNA的5’端种子序列的核苷酸与靶mRNA匹配完好，则抑制mRNA的翻译从而沉默靶基因[11]，此类调控见于动物体中。此外，某些 miRNA如 miR-16能够特异结合于某些富含AU元件基因的3’-UTR，指导argonaute蛋白2等组成miRISC的蛋白与TTP结合，以此改变mRNA的半衰期，加速靶mRNA降解[12]。miRNA的正向调节在生物体中并不常见，其中一个典型的例子是人类肝脏特异表达的 miRNA即miR-122，可以结合到肝炎病毒基因组的5’-UTR引起病毒RNA的剧增[13]。

3 miRNAs和心肌纤维化

miRNA在心肌纤维母细胞和心肌细胞里参与基因表达水平的调节，通过与mRNA的3’端相结合来抑制某些关键蛋白质的表达，这些蛋白的减少或缺失改变了心肌间质的生理状态，促进心肌纤维化的发生。而在已有心肌纤维化的心脏里，某些miRNA则通过与表达另外一些关键蛋白质的miRNA结合，可抑制心肌纤维化的发展，不同的miRNA通过不同的靶点参与了心肌纤维化的发展过程。

3.1 miR-21

miR-21是一类促进心肌纤维化的miRNA，临床实验研究已发现[14]主动脉狭窄患者中心肌和循环中miR-21水平增高可以作为反映左心室纤维化的指标。在心肌梗死区，心脏纤维母细胞是主要的细胞成分，参与心肌梗死后的心肌纤维化发生。纤维母细胞中的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)主要和病理过程中的氧化应激有关：包括心肌缺血-再灌注、心力衰竭和炎症过程。细胞外信号调节激酶-丝裂原激活的蛋白激酶(ERK-MAPK)的存在保证纤维母细胞存活和各种生长因子的分泌，可控制心肌间质纤维化范围和心肌细胞肥大。Roy等[15]做原位杂交试验，利用核酸miR-21探针测定miR-21在缺血-再灌注心脏模型中于梗死部位的高表达。并发现miR-21的直接目标是成纤维细胞中的磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)，调整miR-21水平可经PTEN途径控制MMP-2的表达，当miR-21水平升高，抑制了PTEN的表达，PTEN的减少解除了对MMP-2表达的抑制作用，在缺血-再灌注心肌中，MMP-2直接促进了心肌纤维化的发生和心肌机械功能障碍。miR-21还可作用另一靶目标即快速生长发育因子同源蛋白-1[16]，此类物质可以抑制ERK-MAPK的活性。转染了miR-21的纤维母细胞中，同源蛋白-1的mRNA 3’非翻译区被miR-21结合，抑制其表达，ERK-MAPK的活性得到扩大，使得纤维母细胞存活并分泌各种生长因子，促进心肌纤维化的发生。

3.2 miR-29

miR-29则是一类通过作用纤维母细胞中多个靶点抑制心肌纤维化的miRNA。在小鼠心肌梗死模型中，miR-29表达水平下调，而心肌纤维母细胞胶原蛋白、弹性蛋白含量增高，在体内外诱导miR-29上调后，纤维母细胞胶原表达减少；诱导miR-29下调后，Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白以及纤维蛋白原表达量明显增加[17]。Davis等[18]发现当miR-29a表达受到抑制，其抗纤维化作用被削弱。心房纤维化增加，使心房颤动得到维持。Zhang等[19]利用血管紧张素Ⅱ诱导的高血压小鼠模型，制作了敲除miR-29和过表达miR-29的两个实验组，分别用Western-blot观察纤维母细胞的1型胶原纤维(collagen-1)表达量，发现过表达miR-29的实验组collagen-1表达量较敲除miR-29的实验组明显升高。为了研究miR-29与TGF-β1途径的关系，他们观察到在野生型Smad3小鼠模型上，miR-29表达受到抑制，而敲除了Smad3基因后，miR-29表达上升，揭示了miR-29可能是通过依赖Smad3的TGF-β1途径参与纤维母细胞表达collagen-1。而李宁[20]在正常人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)标本和经TGF-β1诱导HTFs活化的细胞中转染miR-29，后经聚合酶链式反应测定miR-29b的靶基因PI3Kp85a、Spl、C0L1A1的miRNA表达水平明显下降，而这些基因相应的蛋白质表达水平也明显下调。PI3K/Akt信号通路能够增加TGF-β1作用所导致的P-Akt的增加和C0L1A1胶原表达，在TGF-β1作用下，活化的Akt参与了C0L1A1的表达。而miR-29b直接与PI3Kp85a、Spl和CollAl的3’-UTR相结合，通过抑制PI3K/Akt/Spl信号通路的磷酸化水平来调控C0L1A1胶原的表达。这些研究成果表示，miR-29在纤维母细胞中的作用靶点有多样性，但是其在纤维化中所起的保护作用是能得到肯定的，这揭示 miR-29可以作为一种治疗慢性心血管病心肌纤维化的新方法。

3.3 miR-133

miR-133主要通过TGF-β1途径参与心肌纤维化的调节。如前述，TGF-β1可以刺激体外化学合成和Ⅰ型胶原蛋白的沉积[21-22]，是心脏疾病中促进心肌纤维化的主要的决定性因素[23-24]。犬心房颤动模型中发现，miR-133和miR-590表达明显下降，而TGF-β1表达明显升高；过表达的miR-133和miR-590会抑制TGF-β1的蛋白表达量，证实了miR-133和miR-590可抑制靶基因TGF-β1的表达水平[25]。另有研究发现miR-133和CTGF也有密切的相关性，CTGF主要通过调节细胞外基质促进心肌纤维化，是在心肌纤维化过程中起关键作用的一类蛋白质[26]。在人工培育的心肌细胞和心肌纤维母细胞中敲除miR-133基因后发现CTGF表达水平增加，细胞外基质合成也相应增加，促进了心肌纤维化，而使miR-133过表达后，CTGF表达水平则下降[27]，提示miR-133参与心肌纤维化的下调。

3.4 miR-122

miR-122也是一种通过TGF-β1途径参与心肌纤维化调节的miRNA。Javier 等[28]对严重主动脉瓣狭窄患者心肌细胞研究中发现了miR-122和TGF-β1存在密切关系，按照胶原容积百分比(CVF)分组，CVF>15%为实验组，CVF<15%为对照组，结果分析实验组的miR-122较对照组降低，而TGF-β1较对照组升高。用miR-122转染的心肌细胞相较于对照组心肌细胞TGF-β1表达下降，而使用锁核酸抑制miR-122的表达，TGF-β1的表达上升。两者之间有负相关的存在关系。以此推断miR-122可能结合TGF-β1的mRNA的 3’-UTR，抑制其表达。因此，miR-122的高表达，可抑制TGF-β1的表达，以此发挥其抗心肌纤维化的作用。

3.5 miR-34a

miR-34a是一类通过TGF-β1/Smad4途径发挥作用参与调解心肌纤维化的miRNA。Smad4基因是被鉴定的一个肿瘤基因，它的表达产物是转导TGF-β信号的重要胞浆内信号级联分子，它与活化的受体激活型Smad分子形成复合物，移位到细胞核，与其他转录因子协同作用，调节TGF-β应答基因的转录。Huang等[29]培养转染miR-34a的前体细胞，荧光标记酶活性对野生型Smad4基因的3’-UTR活性下降，后用siRNA迅速阻断Smad4表达，则抑制了胶原蛋白-1、TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白的转录，同时miR-34a诱导相关的蛋白质含量也有下降，证明了miR-34a直接控制Smad4调控TGF-β1的表达，从而控制心肌纤维化的发生发展。此外，Boon 等[30]在研究miR-34a的靶目标时发现了另一种和年龄相关的基因即PNUTS(PPP1R10)。miR-34a显著表达于心肌细胞，加速老化型的小鼠心肌细胞中miR-34a的表达水平增加；而miR-34基因敲除的小鼠和年龄相关的心功能下降被阻止，且更少地表现出心肌肥厚和心肌细胞死亡。逆转录实验证明miR-34a与PNUTS 3’-UTR结合，且miR-34a和PUNTS蛋白表达量之间有计量依赖性的反比关系，证明miR-34a抑制PNUTS表达。PNUTS的功能已被证实有4种：(1)能降低端粒缩短；(2)DNA损伤反应；(3)心肌细胞的程序性细胞死亡；(4)促进急性心肌梗死后的心功能恢复。PNUTS在促进急性心肌梗死后心功能恢复时势必是以阻止或改善心脏重塑为手段，这潜在提示PNUTS可能是通过心肌纤维化机制中某个节点来发挥其心脏重塑的负调节作用。这些研究提示miR-34a不仅可以通过TGF-β1途径，而且可以通过PNUTS途径来调节心肌纤维化，为日后研究抗心肌纤维化的策略提供了新的方向和思路。

4 展望

在观察学习各类miRNA与心肌纤维化作用机制的同时，对确定miRNA在心脏疾病诊疗中的价值有着振奋人心和充满希望的预想。目前已有研究证实了一些miRNA在心肌疾病中的诊断价值。miRNAs是在决定蛋白质表达的基因层面和拥有级联放大反应特点的相对分子机制层面表现出其作用，可对疾病提供更准确、更有效率的诊断和治疗手段。随着医学诊疗技术的革新，今后必将为miRNAs的诊疗价值提供优越的施展空间。

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Research Progress of the Relationship Between miRNA and Myocardial Fibrosis

CAO Shuai1,WEI Ling1,2

(1.KunmingMedicalUniversityGraduateSchool,Kunming650000,Yunnan,China；2.CivilCadres’ward，KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryAreaCommand，Kunming650000,Yunnan,China)

Myocardial fibrosis is a pathological process that a variety of heart diseases commonly experience in clinical practice.Myocardial fibrosis has a grave impact on cardiac function，reconstitution of cardiac cell and the electrical conduction of the heart.In addition，miRNA is a type of single noncoding RNA fragment，which is composed of approximately 16 to 22 units of nucleotide molecules.It is involved in a various physiological and pathological processes in the form of a genetic expression regulator.In myocardial fibrosis development process，a number of miRNA have been found to be involved and play pivotal roles.Some miRNA facilitate the process of myocardial fibrosis，while other miRNA restrain the process instead to protect the myocardium.Studying the relationship between miRNA and myocardial fibrosis would enrich practitioners’ insights and affect the way of thinking during clinical diagnosis and treatments.This article summarizes the recent study of miRNA that exert their influences during the process of myocardial fibrosis.

Myocardial fibrosis;miRNA;Mechanism

曹帅(1990—)，硕士，主要从事心力衰竭、心律失常研究。Email：314981465@qq.com

R542.2+3

A 【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2016.06.016

2015-11-25

2016-07-18