脂肪干细胞在急性心肌梗死中的研究进展

黄露露 综述 何胜虎 审校

(1.中南大学湘雅医学院，湖南 长沙 410000；2.江苏省苏北人民医院心内科，江苏 扬州 225001)



脂肪干细胞在急性心肌梗死中的研究进展

黄露露1,2综述 何胜虎2审校

(1.中南大学湘雅医学院，湖南 长沙 410000；2.江苏省苏北人民医院心内科，江苏 扬州 225001)

脂肪干细胞具有自我更新能力，并具有向多种细胞分化的潜能，经诱导后可分化为心肌细胞，其来源广、数量多、取材容易、易于培养、自体移植无免疫排斥反应、不存在伦理问题等优点，使其成为了干细胞移植中细胞来源的研究热点，具有治疗心肌梗死的巨大潜力和良好的临床应用前景。

脂肪干细胞；急性心肌梗死；干细胞移植

心血管疾病的发病率和病死率在全球非常高，有研究显示[1]，2010年中国急性心肌梗死的发病率为48.75/10万，目前仍有上升趋势，发病群体也更加年轻化，越来越多的急性心肌梗死患者缺乏已知的危险因素，随着生活条件改善，急性心肌梗死的发病率还会进一步升高。

心肌梗死导致心肌细胞死亡，从而血流动力学紊乱，导致心脏衰竭。目前临床上的治疗方法只能恢复血液再灌注，已坏死的心肌不能被修复或逆转，而心脏移植因缺乏供体、具有排斥反应等严重并发症不能推广。

干细胞移植技术进入人们的视野，为心肌梗死的治疗带来了新曙光，已用来修复梗死心肌，改善心功能。相较于胚胎干细胞因伦理问题受限，成人自体干细胞无疑是较好的选择，尤其当应用骨骼肌成肌细胞[2]、骨髓干细胞[3]治疗心肌梗死取得一定疗效后，前景一片看好，但因获取细胞的途径及数量少使得研究者们对资源丰富的细胞更感兴趣。

2001年，Zuk等[4]发现人的脂肪组织存在一种细胞群，具有自我更新，并向多种细胞分化的潜能，命名为脂肪源性干细胞，2004年国际脂肪组织应用技术协会统一将其命名为脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)[5]。更进一步发现其经诱导后可分化为心肌细胞，具有治疗心肌梗死的巨大潜力。

1 脂肪干细胞分子生物学特性

1.1 分离、培养、扩增

目前，许多研究都是在利用胶原酶消化脂肪组织后行离心培养的基础上进行，随着实验方法的改进，脂肪干细胞的提取率也随之升高。人类脂肪组织的获取一般是手术中切取部分脂肪组织或抽吸法，有研究表明[6-7]抽吸300 mL脂肪组织，可提取出约107个ASCs，纯度为95%，但因负压所造成的机械损伤使得抽吸法获得的ASCs的成活率较直接切取低。在不同部位取材的ASCs的提取率的差异性目前仍存在争议。

在脂肪组织中提取出的ASCs的成活率不高，要获得大量的干细胞必须进行体外分离扩增。常用的方法为胶原酶消化法：将脂肪组织剪碎，去除血管及纤维组织，用胶原酶消化后离心，沉淀物经红细胞裂解液裂解后用含胎牛血清的培养液洗涤并重悬，接种于培养瓶内，于37 ℃，5%的CO2饱和湿度培养箱中静置培养。培养24 h后首次换液，此后可每3 d换液一次，待细胞融合达80%～90%可按1∶2或1∶3传代，继续扩增。体外培养时，ASCs对培养液要求不高，不用添加生长因子等添加物就能生长，细胞的生长和表型不受低温冻存的影响。有研究报道[8]，原代培养传至18代后，其生物学特性仍能保持稳定，凋亡率很低，提示ASCs的体外扩增和自我更新能力较强。

1.2 鉴定

1.2.1 形态

纺锤形或梭形，细胞核居中，可双核或多核，核仁明显；60 h时细胞逐渐增大，以梭形为主；经三四代培养后，梭形细胞大量增殖，可局部融合呈漩涡状或平行排列，胞质和核仁丰富，类似成纤维细胞。田霖等[9]培养人的脂肪干细胞，4～8 d后进入指数增长期，9～10 d后进入平台期，第三代对数期倍增时间为37.20 h。而吴尉等[8]的实验在第2～4天处于指数生长期，6～7 d进入平台期，第三代对数期倍增时间为45.90 h，经过对比考虑实验研究结果的差异可能与个体性别、红细胞裂解液对原代细胞的损伤、接种密度等因素有关，但仍需更多的研究报道明确。另外，有研究发现人脂肪干细胞在连续传代25代后出现染色体核型等的改变[10]，同时也有研究并未发生上述改变，证实了人脂肪干细胞在体外培养过程中能保持稳定的二倍体结构，有一定的遗传稳定性；但是仍需更多的相关研究报道支持，指导后续的体外细胞移植。

1.2.2 表面抗原

目前对于ASCs的细胞表面标记尚缺乏统一标准，但通过免疫组化或流式细胞仪技术检测发现大多都有表达CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD90、CD105；而不表达CD14、CD45、CD116、人类白细胞抗原DR；对于CD34、CD106、CD49d、基质细胞抗原尚存在争议，大部分ASCs主要表达组织相容性抗原Ⅰ，而不表达或低表达组织相容性抗原Ⅱ，可抑制混合淋巴细胞反应，表明ASCs具有低免疫原性，具有细胞移植的巨大潜力。

1.2.3 基因、蛋白

对于脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞的来源认定仍存在争议，甚至不认可脂肪组织提取物ASCs是干细胞；但是，在Peroni等[11]的研究中可以发现ASCs与骨髓间充质干细胞可表达多种相同的基因，如 UTF-1、Nodal和Snail2，而这几种基因是胚胎干细胞特有的基因表达物，提示ASCs与骨髓间充质干细胞的基因表达有许多相似之处，涉及细胞黏附因子、基质蛋白、生长因子、生长因子受体和蛋白酶等，为ASCs的潜在治疗应用提供了支持的依据。

1.3 诱导分化潜能

已有多项研究表明脂肪干细胞具备多向分化潜能，可分化为中胚层起源的脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、心肌细胞；外胚层起源的神经细胞、星形胶质细胞；还有分化为内胚层起源的肝细胞、胰腺细胞等多种细胞的潜力。另外，组织供体的性别、年龄、获取部位、传代次数、保存方法等的不同，也会影响ASCs的诱导分化能力，如小鼠来源的ASCs优于人来源，皮下组织来源优于其他组织；心脏获得的脂肪干细胞较其他部位倍增时间更短，分化潜能更大[12-13]。

ASCs在特殊的生长因子和环境的培养下，其生长和分化方向不同。比如牛血清、转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子2可促进ASCs细胞生长，而马血清有助于细胞分化。体外培养ASCs时向培养基中添加胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤、间充质介质细胞生长添加物和L-谷氨酰胺或吲哚美辛诱导向脂肪细胞分化；添加地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸盐和维生素D诱导向成骨细胞分化；添加抗坏血酸、胰岛素、地塞米松、TGF-β联合诱导向软骨细胞分化；骨形态蛋白-6、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子(EGF)也有诱导分化的作用；添加地塞米松、马血清利于向骨骼肌细胞分化；添加TGF-β1、5-氮杂胞苷诱导向平滑肌细胞分化；添加血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导向内皮细胞分化；添加TGF-β1、血管内皮生长因子、干扰素3、干扰素6、干细胞因子及5-氮杂胞苷诱导向心肌细胞分化[14-15]，双相脉冲电刺激[16]亦促进向心肌细胞分化；含有胰岛素吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤、EGF、bFGF可诱导向神经细胞和神经胶质细胞分化；添加制瘤素M、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞因子、bFGF诱导向肝细胞分化；bFGF、尼克酰胺参与了诱导分化为胰腺细胞；含有EGF、角质细胞生长因子、HGF可诱导向表皮细胞分化。

2 脂肪干细胞在急性心肌梗死中的应用

急性心肌梗死的发病率居高不下，发病群体日益年轻化，是人类健康的严重威胁。虽然随着科学技术的发展，病死率有所下降，但因其造成的不可逆损伤，使患者的生活质量下降。心脏中的心脏干细胞数量较少，再生能力极为有限，难以补足因心肌梗死而丧失的大量心肌细胞，且心脏干细胞难以分离、培养、扩增和分化，无法成为干细胞移植的主要细胞来源。ASCs在创伤修复领域的成果引起了人们的关注，并将其作为移植供体细胞的猜想付诸于实践，取得了成就，提示此猜想在不久的将来有实现的可能。

2.1 急性心肌梗死的机制

急性心肌梗死是冠状动脉急性缺血缺氧所引起的心肌坏死。典型的急性心肌梗死是因冠状动脉血管的急性闭塞，导致局部心肌缺血，使心脏收缩力减弱，发生心律失常和心力衰竭的风险增加。若不能及时恢复血流，则心肌严重受损，心脏功能随之发生急性或慢性改变。目前临床上治疗心肌梗死的方法包括药物溶栓、经皮冠状动脉介入术及冠状动脉旁路移植，虽然可以改善心脏功能，但不能使受损的心脏组织再生。

2.2 脂肪干细胞治疗心肌梗死的机制

诸多动物实验证明，ASCs可以减轻心肌梗死动物模型的心脏损伤并有效改善左心室功能。目前认为，其机制可能有以下几点：(1)植入后的ASCs分化为心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞，促进血管形成及受损心肌修复；(2)激活心脏内的心肌干细胞；(3)通过旁分泌功能来改善梗死区微环境，保护局部心肌并促进增殖。干细胞在心肌梗死的微环境中凋亡率>95%，但脂肪组织中氧气质量浓度低，一般小于3%，有研究[17]表明脂肪干细胞在1%的低氧环境中能促进血管内皮生长因子、HGF等的分泌，Kim等[18-19]得到相似的结果，其进一步研究更提示中、低量活性氧能改善脂肪干细胞扩增、迁移以及再生的能力，但仍需进一步的体内研究。

2.3 移植途径

目前移植途径包括经心内膜下注射、开胸心内注射、冠状动脉内注射、静脉注射及组织工程。干细胞移植后可能引起诸多不良反应，包括多器官种植、癌基因转化、意外细胞分化、心律失常、加速动脉粥样硬化及冠状动脉血栓形成等。

2.4 移植时机

急性心肌梗死后，其炎症反应强，干细胞不易存活，在心肌梗死后2周，炎症反应消退，瘢痕尚未形成，此时移植存活可能性大。但也有人认为在心肌梗死急性期行移植，植入的细胞可以释放一些细胞因子，利于缺血再灌注后心脏功能的恢复。移植时机的选择尚需要更多的实验结果来辅助。

3 脂肪干细胞在急性心肌梗死治疗中的机遇与挑战

急性心肌梗死是一种常见的危及生命的心血管疾病，而干细胞移植是一种全新的治疗方式。但自体移植的细胞来源仍然是一个巨大的挑战。目前针对心肌干细胞移植研究的较多的干细胞资源主要有胚胎干细胞、心肌干细胞、成体干细胞(骨骼肌干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞及肝脏干细胞等)。然而，胚胎干细胞因免疫排斥和伦理问题而使其临床应用面临巨大的挑战；心肌干细胞的存在尚存争议，其来源、数量、培养、诱导分化也缺乏有力的证据；自体干细胞中骨骼肌细胞移植虽能改善心功能，但不能分化成心肌细胞，是否具备心肌细胞的电生理特性及同步收缩仍缺乏证据，易发生心律失常；骨髓干细胞经诱导可分化为心肌细胞，促进再生血管形成，但对心脏功能改善有限；脂肪干细胞具有自我更新能力和多分化潜能，已被证实可分化为心肌细胞、血管内皮细胞，在促进心肌再生的同时，也导致了新生血管形成，能有效改善心功能。

脂肪干细胞来源广、数量多、取材容易、易于培养、多项分化潜能、自体移植无免疫排斥反应、不存在伦理问题等优点，使其成为了干细胞移植中细胞来源的研究热点。目前，脂肪干细胞移植对心肌梗死的治疗研究仍处于临床试验阶段。有实验表明利用基因技术对ASCs进行改良[20]、预处理ASCs并优化心肌细胞生存微环境[21]，均能有效提高ASCs治疗急性心肌梗死后的治疗效果，而糖尿病患者的ASCs分化潜能降低，且能分泌阻碍细胞信号传导的因子致疗效降低[22-23]；ASCs在有HGF和胰岛素样生长因子-1的环境中，虽能改善心功能，但是易诱发心律失常[24]。

目前，对ASCs分化为心肌细胞及内皮细胞的深层机制尚未明确，体外长时间保存后，其增殖和分化能力也有降低趋势，其分离和培养方法仍需完善。有些实验室的结果还不能完全肯定，而且，在ASCs的应用上，尚存在移植细胞成活率低、性能不稳定、最佳细胞移植时机及移植区血运建立等问题，需要大规模随机对照的临床研究进一步证实它的有效性和安全性及移植后的长期观察。

通常ASCs在体外经过2～5个通路进行转化至少需要2～5周，限制了其对急性心肌梗死后的床边治疗，然而随着研究的不断深入，未来可以通过研究ASCs的免疫特性来实现异体治疗的可能，应用ASCs治疗心血管疾病必定会有更广阔的前景。

[1] 刘晓婷,李镒冲,姜勇,等.2010年我国急性心肌梗死疾病负担分析[J].中国慢性病预防与控制，2013,21(3):271-273.

[2] Povsic TJ，O’Connor CM，Henry T，et al.A double-blind，randomized，controlled，multicenter study to assess the safety and cardiovascular effects of skeletal myoblast implantation by catheter delivery in patients with chronic heart failure after myocardial infarction[J].Am Heart J,2011,162(4):654-662.

[3] Liu B，Duan CY，Luo CF，et al.Effectiveness and safety of selected bone marrow stem cells on left ventricular function in patients with acute myocardial infarction:a meta-analysis of randomized controlled trials[J].Int J Cardiol,2014,177(3):764-770.

[4] Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2):211-228.

[5] Poglio S，de Toni-Costes F，Arnaud E，et al.Adipose tissue as a dedicated reservoir of functional mast cell progenitors[J].Stem Cells,2010,28(11):2065-2072.

[6] Mizuno H，Tobita M，Uysal AC.Concise review:adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine[J].Stem Cells,2012,30(5):804-810.

[7] Boquest AC，Shahdadfar A，Brinchmann JE，et al.Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue[J].Methods Mol Biol,2006,325:35-46.

[8] 吴尉,梁芳,宋小琴,等.人脂肪干细胞的提取和鉴定[J].中国组织工程研究,2015,19(28):4498-4502.

[9] 田霖,孙筱放,刘海波,等.人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性[J].中国组织工程研究,2012,16(32):5946-5952.

[10] 张卫泽,李国庆,陈永清,等.人脂肪间充质干细胞的分离培养及其遗传稳定性[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,40:7833-7837.

[11] Peroni D，Scambi I，Pasini A，et al.Stem molecular signature of adipose-derived stromal cells[J].Exp Cell Res,2008,314(3):603-615.

[12] Wystrychowski W，Patlolla B，Zhuge Y，et al.Multipotency and cardiomyogenic potential of human adipose-derived stem cells from epicardium，pericardium，and omentum[J].Stem Cell Res Ther,2016,7(1):84.

[13] Nagata H，Ii M，Kohbayashi E，et al.Cardiac adipose-derived stem cells exhibit high differentiation potential to cardiovascular cells in C57BL/6 mice[J].Stem Cells Transl Med,2016,5(2):141-151.

[14] Carvalho PH，Daibert AP，Monteiro BS，et al.Differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes[J].Arq Bras Cardiol,2013，100(1):82-89.

[15] Gwak SJ，Bhang SH，Yang HS，et al.In vitro cardiomyogenic differentiation of adipose-derived stromal cells using transforming growth factor-beta1[J].Cell Biochem Funct,2009,27(3):148-154.

[16] Li Z，Yang G，Huang H，et al.Biphasic pulsed electrical stimulation promotes the differentiation of adipose-derived stem cells into cardiomyocyte-like cells[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi,2015,31(9):1200-1204，1210.

[17] 姜亦瑶,刘晓程,裴宇,等.不同氧分压时人脂肪干细胞细胞因子的分泌[J].中国组织工程研究,2013,17(45):7861-7868.

[18] Kim JH，Park SH，Park SG，et al.The pivotal role of reactive oxygen species generation in the hypoxia-induced stimulation of adipose-derived stem cells[J].Stem Cells Dev,2011,20(10):1753-1761.

[19] Park SG，Kim JH，Xia Y，et al.Generation of reactive oxygen species in adipose-derived stem cells:friend or foe?[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(11):1297-1306.

[20] Paul A，Nayan M，Khan AA，et al.Angiopoietin-1-expressing adipose stem cells genetically modified with baculovirus nanocomplex:investigation in rat heart with acute infarction[J].Int J Nanomed,2012,7:663-682.

[21] Hoke NN，Salloum FN，Kass DA，et al.Preconditioning by phosphodiesterase-5 inhibition improves therapeutic efficacy of adipose-derived stem cells following myocardial infarction in mice[J].Stem Cells,2012,30(2):326-335.

[22] Koci Z，Turnovcova K，Dubsky M，et al.Characterization of human adipose tissue-derived stromal cells isolated from diabetic patient’s distal limbs with critical ischemia[J].Cell Biochem Funct,2014,32(7):597-604.

[23] Ferrer-Lorente R，Bejar MT，Tous M，et al.Systems biology approach to identify alterations in the stem cell reservoir of subcutaneous adipose tissue in a rat model of diabetes:effects on differentiation potential and function[J].Diabetologia,2014,57(1):246-256.

[24] Savi M，Bocchi L，Fiumana E，et al.Enhanced engraftment and repairing ability of human adipose-derived stem cells，conveyed by pharmacologically active microcarriers continuously releasing HGF and IGF-1，in healing myocardial infarction in rats[J].J Biomed Mater Res A,2015,103(9):3012-3025.

Progress of Adipose Derived Stem Cells in Acute Myocardial Infarction

HUANG Lulu1,2,HE Shenghu2

(1.XiangYaSchoolofMedicine,CSU,Changsha410000，Hunan,China;2.NorthernJiangsuPeople’sHospital,Yangzhou225001,Jiangsu,China)

Adipose-derived stem cells(ASCs) are capable of self-renewal，and after induction can differentiated into a variety of cells，including myocardial cells.ASCs have the advantage of a wide range of sources，a large number of materials，are easy to take，easy to cultivate，no immune rejection of autologous transplantation or ethical issues and is the research focus of cell source in stem cell transplantation.With the progress of study，ASCs may provide a new promising treatment of acute myocardial infarction in the future.

Adipose-derived stem cells；Acute myocardial infarction；Stem cell transplantation

黄露露(1990—)，住院医师，在职硕士，主要从事冠心病研究。Email：lulu2007jie@sina.com

何胜虎(1963—)，主任医生，硕士，主要从事冠心病介入性诊断与治疗研究。Email：yzhshys@163.com

R542.2

A 【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2016.06.010

2016-05-14

2016-08-19