黑色素瘤动物模型治疗相关机制研究进展

任　敏，李东霞

(内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050)



综述

黑色素瘤动物模型治疗相关机制研究进展

任敏，李东霞

(内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050)

[关键词]黑色素瘤；动物模型；治疗机制

黑色素瘤源于神经脊黑素细胞，多发生于皮肤，由细胞色素痣、发育不良痣演变或新发而成，与紫外线照射、创伤与刺激、免疫抑制、家族遗传等因素有关[1]。目前，黑色素瘤占皮肤恶性肿瘤的第三位，每年仍以4%～6%的速度增长[2]。多数早期患者通过手术能够治愈，但晚期黑色素瘤患者的预后差，转移性黑色素瘤患者中位生存期仅为6～9个月，5年生存率不足5%[3]。近年来，随着对黑色素瘤侵袭、增殖及转移分子机制认识的不断加深，黑色素瘤的基因免疫治疗方面取得了显著的成果，部分被应用于临床[4]。笔者就近年来相关文献对黑色素瘤的动物模型建立及其治疗相关机制方面进展综述如下。

1黑色素瘤动物模型的构建

目前常用于肿瘤研究的动物模型有自发瘤模型、诱导模型、转基因动物模型和移植模型[5]。黑色素瘤的研究中以移植模型最为常见，根据其移植物的不同可进一步分为黑色素瘤外科标本移植模型及细胞株移植模型。而影响黑色素瘤动物移植模型建立成功的因素众多，与黑色素瘤细胞或外科标本的特性、移植部位及移植黑色素瘤细胞的数量、动物的品系和周龄以及生长环境有关。

1.1构建黑色素瘤动物模型的动物种类目前报道的应用于抗黑色素瘤作用及机制体内试验研究的动物种类较多，主要有小鼠，其中包括BALB/c、C57BL、DBA/2、裸小鼠(nude mice)、Scid小鼠等。大鼠，其中包括Fisher、裸大鼠、SD(Sprague-Dawley)、Wistar大鼠等品种。其他还有兔、猪、恒河猴等，其中以小鼠应用较多[6]。

1.2黑色素瘤组织移植模型取人或动物新鲜的黑色素瘤组织，短时间内移入动物皮下，因免疫排异反应，一般采用免疫缺陷动物移植。吴海燕等[7]建立免疫细胞缺陷的BNX 小鼠 (T、B、NK 细胞功能缺陷)B16黑色素瘤细胞移植模型，通过皮下移植—肺转移—皮下移植的途径筛选出具有高转移特点的小鼠皮下黑色素瘤模型，更好地反映了黑色素瘤的临床特征。姚明等[8]将人黑色素瘤皮下移植至Scid小鼠皮下，反复筛选出了具有自发肺转移并淋巴结转移的动物模型。组织移植成功率较低，但移植后的黑素瘤仍保持原有的功能和形态，更能真实地反应黑素瘤侵袭、转移的过程。

1.3黑色素瘤细胞移植模型黑色素瘤细胞移植模型是指将人或动物黑素瘤细胞接种于动物体内，张燕等[9]采用不同浓度的B16黑色素瘤细胞悬液注射于C57BL/6小鼠背部，发现随着浓度的升高小鼠的出瘤时间及生存期随之缩短。当浓度太大时不宜推注，以109L-1时为最适浓度。黑色素瘤细胞移植模型成功率高于组织移植，并且黑色素瘤组织可由细胞移植获得，获取时间较为确定，是目前研究最多的黑色素瘤移植模型。

2黑色素瘤动物模型的中药治疗研究

近几年，黑色素瘤的中药治疗引起了越来越多国内外专家学者的关注。 中药成分抗黑色素瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点，其在抑制黑色素瘤血管生成、DNA的合成以及增强肿瘤转移抑制基因的表达等方面有显著作用。

2.1影响肿瘤转移相关基因的表达袁波等[10]对黑色素瘤肺转移B16小鼠的研究中发现益气败毒汤组与环磷酰胺(CTX)组相比疗效尚有差距，与生理盐水组相比小鼠肺转移的肿瘤数明显减少，实验证实CTX及益气败毒汤经胃管给药治疗后，小鼠肺肿瘤组织中肿瘤转移抑制基因nm23的表达强度明显增强，且组间nm23基因强度的表达差异无统计学意义。可见中药制剂益气败毒汤可通过调控肿瘤转移相关基因nm23影响黑色素瘤的转移。

2.2对免疫系统的影响来改善黑色素瘤程序性死亡因子1/程序性死亡因子配体(PD-1/PD-Ls)通路的活化可抑制效应T细胞的细胞因子分泌以及增殖活化并促进T细胞的凋亡，进而引发抗肿瘤免疫的失活及肿瘤免疫逃逸[11]。中药黄芪多糖可抑制与免疫细胞活性负相关PD-1/PD-Ls通路以及减少免疫负性调控细胞调节性T细胞(Treg)的数目来抑制黑色素瘤的生长。负性调控细胞Treg可直接抑制T细胞的活化、增殖及相关免疫功能来影响肿瘤生长。王洁茹等[12]在黄芪多糖调节黑色素瘤小鼠PD-1/PD-Ls分子表达的研究中证明黄芪多糖抑制共刺激分子 PD-1/PD-Ls 的表达，推测这种作用通过增强小鼠 T 淋巴细胞抗肿瘤免疫活性而抑制肿瘤的生长。张舒玉等[13]认为黄芪多糖可能通过降低荷瘤鼠脾脏中调节性T细胞(Treg)数目，抑制转化生长因子-β(TGF-β)，白细胞介素-10(IL-10)分泌，从而实现其抑瘤作用。

2.3对黑色素瘤血管生成的影响近年来研究发现三氧化二砷(As2O3)及白术内酯I抑制黑色素瘤的主要机制是抑制肿瘤中血管的生成。李楠等[14]通过活体成像技术发现经三氧化二砷腹腔注射的小鼠黑色素瘤组织血管密度显著降低，肿瘤组织中心发生坏死，抑制了肿瘤的生长及转移，其抑制肿瘤血管的机制还需进一步研究。潘利文等[15]实验证实白术内酯I能够显著抑制血管内皮成管可能与其抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长有关。

2.4抑制黑色素瘤组织内细胞表达基质金属蛋白酶(MMPs)MMPs是一组Zn2+依赖性肽酶，可以降解多种细胞外基质和基底膜中的胶原成分，从而促进肿瘤侵袭转移及血管生成，其中又以MMP-2和MMP-9研究较多[16]。姜新等[17]实验证实人参皂苷Rg3能够抑制小鼠黑色素瘤细胞表达MMP-9，使肿瘤的侵袭能力降低抑制黑色素瘤的转移。韩丽娜等[18]在木鳖子醇提物抑制小鼠黑素瘤B16细胞体内外侵袭转移的实验研究中证实木鳖子醇提物能下调B16细胞中MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白水平，但不能降低金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1、TIMP-2)的表达。推测木鳖子醇提物抑制黑素瘤B16细胞侵袭的作用机制与其抑制MMP-2和MMP-9的表达有关。

3黑色素瘤动物模型的基因治疗研究

基因治疗作为黑色素瘤的一种靶向治疗已取得一定效果。常见的有自杀基因疗法、癌基因信号通路的阻断、基因失活、增强抑癌基因的表达、阻断肿瘤血液供应等。

3.1自杀基因疗法自杀基因疗法是将某些细菌和病毒的基因导入肿瘤细胞，通过相关药物杀死携带该基因的受体细胞。曾玲等[19]建立具有绿色荧光蛋白(GFP)示踪功能的单纯疱疹病毒 1 型胸苷激酶基因/更昔洛韦自杀基因系统(HSV1-tkGFP/GCV)，实验证实重组 HSV1-tkGFP/GCV 系统存在一定的旁杀效应，对小鼠黑色素瘤有明显抑制作用。

3.2癌基因信号通路的阻断细胞信号通路是细胞通过胞膜或胞内受体感受信息分子的刺激，经细胞内信号转导系统转换，从而影响细胞生物学功能的一系列酶促反应通路。研究发现,Notch 信号通路与肿瘤的发生关系密切，可通过Notch受体与相邻细胞表面的配体结合导致肿瘤的发生[20-21]。齐艳霞等[22]在Notch1 siRNA对小鼠恶性黑色素瘤细胞抑瘤作用的研究中证实靶向 Notch1基因小干扰RNA(siNotch)下调Notch1的表达，明显减缓了小鼠成瘤速度，从而抑制黑色素瘤的发展。

3.3抑癌基因的研究抑癌基因通过表达抑制细胞增殖和促进细胞分化的各种因子在细胞的正常周期中发挥重要的作用，抑癌基因的失活使激活的癌基因发挥作用，导致细胞失去正常生长的调控发生癌症。LKB1基因为公认的抑癌基因，实验证实LKB1基因与黑色素瘤关系密切，它的失活将导致高转移性黑色素瘤细胞的产生[23]。发生LKB1基因缺失的黑色素瘤患者预后不良，黑色素瘤发生LKB1基因缺失的发生率约占10%。目前尚不能确定LKB1缺失导致肿瘤转移的机制，推测LKB1的缺失与激活驱动肿瘤转移蛋白的src激酶有关。李宗河等[24]采用不同浓度的腺病毒介导携带绿色荧光蛋白的nm23-H1基因药物(Ad-GFP-nm23-H1)对裸鼠移植A375实体瘤注射，发现对裸鼠黑色素瘤具有明显的抑制作用，且随着剂量的增大抑瘤作用越明显。李鹤等[25]采用携带mda-7基因的腺病毒(Ad·mda-7)与达卡巴嗪(DTIC)联合治疗裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤模型，瘤体内注射病毒Ad·mda-7，腹腔注射DTIC，肿瘤生长速度明显变慢。

3.4对肿瘤血管生成的影响肿瘤新生血管壁薄，缺乏基底膜，为肿瘤的转移提供了良好的条件，新生血管的不断形成可为肿瘤提供营养支持，是肿瘤生长步骤之一[26]。在抵抗肿瘤的血管生成中，内皮抑素的作用至关重要。曹瑞华等[27]采用腺病毒介导的内皮抑素基因(Ad-mES)于小鼠黑色素瘤瘤体内注射，肿瘤体积增长减慢，认为原因可能为肿瘤血管的内皮细胞在内皮抑素的作用下凋亡，阻断了肿瘤的血液供应，从而达到抑制肿瘤生长转移的效果，除了这种经典肿瘤血管生成途径之外，亦有研究发现多种恶性肿瘤中存在由肿瘤细胞围成的管道结构血管生成拟态(VM)，谢群等[28]在对小鼠黑色素瘤VM的研究中发现蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白(sv-cystatin)能抑制VM的形成。

4黑色素瘤动物模型的免疫治疗研究

黑色素瘤的免疫治疗是采用主动免疫和被动免疫治疗的方法，激发和调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。

4.1树突状细胞疫苗激活小鼠T淋巴细胞免疫反应树突状细胞(DC)为功能最强的抗原提呈细胞，在肿瘤的免疫反应中发挥重要的作用，在肿瘤的免疫反应中树突状细胞提呈的抗原与主要组织相容性复合体Ⅰ(MHC-Ⅰ)相结合，抗原被T细胞识别，促进肿瘤杀伤性T细胞的活化与增殖[29]。齐渊元等[30]通过静脉注射体外制备的荷载CD8杀伤性T细胞表位鸡卵蛋白(OVA)257-264肽段的成熟DC，成功诱导小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫反应，抵抗黑色素瘤的成瘤，为DC肿瘤疫苗的研发提供了一种可行的方法，同时证明了采用静脉注射树突状细胞疫苗能够使疫苗分布于非淋巴器官以及淋巴器官进行T细胞的激活。

4.2MAGE-A基因疫苗诱导特异性CTL的产生MAGE-A基因编码的肿瘤特异性抗原肽能被MHC-Ⅰ分子提呈给细胞毒性T淋巴细胞特异的杀伤肿瘤细胞，发挥抗肿瘤作用。Vogel等[31]在治疗黑色素瘤临床预实验探索中，将痘病毒载体重组的MAGE基因制成疫苗，导入HLA-A2/K转基因小鼠。结果证实靶细胞转染MAGE-A1、MAGE-A3和MART-1抗原肽疫苗后可诱导特异性CTL的产生，从而发挥CTL细胞的抗肿瘤作用溶解自体和异体同源的肿瘤细胞。

4.3黑色素瘤的过继免疫治疗将具有特异性的肿瘤杀伤性细胞在体外大量扩增后回输到荷瘤体内达到抗肿瘤的目的，但由于肿瘤微环境中复杂的免疫抑制网络，使肿瘤发生免疫耐受。调节性T细胞(Tregs)在肿瘤的免疫耐受中发挥着重要的作用[32]。李卫泊等[33]将体外制备的针对B16细胞的大量CTLs回输到荷瘤小鼠体内并联合CTX腹腔注射治疗，发现对肿瘤的生长有明显的抑制作用。李冬斌等[34]在研究半相合基因肿瘤特异性树突状细胞活化的特异性CTL(DCs-CTL)对小鼠黑色素瘤的抑制作用及其移植物抗宿主反应(GVHD)反应中，采用半相合基因鼠来源的DCs-CTLs效应细胞经鼠尾静脉回输，小鼠肿瘤质量减少且均未见明显GVHD病理变化。

5展望

黑色素瘤是个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病，随着对黑色素瘤发病机制认识的不断加深，近年来，黑色素瘤动物试验的研究取得了巨大的成果，本研究已列举了众多黑色素瘤动物实验中，中药、基因靶向研究及免疫研究方面的进展，为其应用于临床试验奠定了基础。但是目前仍存在一些问题有待解决。首先，探索黑色素瘤侵袭转移的分子生物关键机制，并寻找阻断其发展的关键药物将成为今后研究的热点之一；其次，实现黑色素瘤的早发现，早诊断，早治疗，在此基础上探索针对黑色素瘤早期的、敏感的、特异的诊断指标。最后，在药物的联合应用方面值得深入研究，关注药物的联合应用是否进一步提高抗肿瘤效果。这些将成为今后黑色素瘤动物实验研究的重点。

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[收稿日期]2015-10-10

[中图分类号]R739.5

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)09-1021-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.042

[基金项目]2014年内蒙古自治区科技计划项目(2014 kjt14sf16)

[通信作者]李东霞，E-mail:ldx828@sina.com