5-脂氧合酶的活性调节及抑制剂研究进展*

秦华迪综述，常　静，秦春常△审校（重庆医科大学附属第一医院：.麻醉科；.心内科，重庆40007）

5-脂氧合酶的活性调节及抑制剂研究进展*

秦华迪1综述，常静2，秦春常2△审校（重庆医科大学附属第一医院：1.麻醉科；2.心内科，重庆400017）

花生四烯酸盐5-脂氧合酶；脂氧合酶抑制剂；活化；调节；综述

5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LO）是催化花生四烯酸（AA）生成具有生物活性的白三烯（leukotrienes，LTs）的关键酶［1］。近年来研究发现，5-LO的调节在哮喘、炎症、过敏性鼻炎、组织缺血再灌注损伤、心血管疾病及部分恶性肿瘤等疾病的发生、发展过程中均有非常重要的意义［2］。因此，关于5-LO酶活性的调节和抑制剂的研发已成为一个热门课题，本文就其活性调节和抑制剂的研究进展综述如下。

1　5-LO酶活性的调节

1.15-LO5-LO在哺乳动物各组织中分布十分广泛，其相对分子质量为72×103～80×103，是由672或673个氨基酸残基组成的单体酶，主要由N-末端的β-barrel结构和催化区域C-末端的α螺旋结构构成。α螺旋结构内含有1个非血红蛋白Fe2+，是反应时电荷的供体和递体。氨基端拥有C2结构含有典型配体结合环，配体结合环能与Ca2+和细胞膜相结合［3］，Ca2+通过诱导5-LO与细胞膜相结合，从而激活5-LO。静息状态下的5-LO在不同的细胞分布不同，如在中性粒细胞，嗜酸性粒细胞或腹膜巨噬细胞中，5-LO最主要分布在细胞质区域；而在肺泡巨噬细胞、朗格汉斯细胞中，5-LO主要分布在细胞核区域。

1.2铁离子与脂质过氧化物5-LO活化中心的非血红素铁离子是5-LO激活所必需的，Hammarberg等［4］通过电子顺磁共振发现静息状态下呈Fe2+形式，激活状态下呈Fe3+形式，在催化过程中铁离子在＋2价和＋3价之间循环。在细胞中，脂质过氧化物能氧化5-LO中的Fe2+转化为Fe3+，使5-LO具有生物活性，但过氧化氢对5-LO无激活作用。Radmark等［5］发现，谷胱甘肽过氧化物酶可以通过减少脂质过氧化物的生成抑制5-LO的活性。

1.3Ca2+5-LO的活性与Ca2+有关，当Ca2+浓度为4～10μmol/L，全部 5-LO的活性可激活；Ca2+浓度为 1～2μmol/L，仅有一半5-LO的活性可激活。但即使无Ca2+，5-LO也具有一定的生物活性［6］。细胞应激反应诱导的5-LO激活就不依赖于Ca2+。每分子5-LO最多可以与2分子Ca2+可逆结合。Ca2+还可以调节5-LO与脂质氢过氧化物的亲和力；Ca2+激活 5-LO需要磷脂酰胆碱（Phos phatidylcholine，PC）或类毛状蛋白（coactosin-likeprotein， CLP）存在，如此Ca2+才能有效地绑定到“支架”上。Ca2+还可对抗谷胱甘肽过氧化物酶对5-LO活性的抑制［7］。此外Mg2+、Ba2+、Sr2+和Mn2+可以部分激活5-LO的活性，但这些+2价阳离子不属于催化机制。

1.4三磷酸腺苷（ATP）最早发现对5-LO酶有激活作用的物质是ATP，但单独的ATP不能激活5-LO的活性，必须在Ca2+同时存在时才能激活5-LO。ATP与5-LO结合使5-LO酶活性增加，对5-LO酶具有稳定作用，但目前ATP与5-LO的结合位点尚未确定。

1.5PCPande等［6］在人类白细胞中提纯5-LO发现，PC能代替细胞膜作为5-LO活性的刺激因子，并且能稳定5-LO活性酶活性。研究发现，5-LO的C2结构对阳性离子的PC的结合力高于阴性离子的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。无Ca2+时，虽然此时PC与5-LO的结合力最大，但这种结合不能激活5-LO［8］；Ca2+存在时，增加5-LO与PC结合的疏水性，变为“生产”模式［6］。有趣的是，加入胆固醇或胆固醇硫酸盐可以抑制5-LO的活性［7］。

1.6甘油酯和CLP研究发现，多种甘油酯均可以激动5-LO活性，但其中1-油酰基-2-乙酰基-sn-丙三醇（1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol，OAG）作用最明显。OAG主要作用于5-LO的C2区域［9］。Ca2+、磷脂、PC可以抑制OAG 对5-LO刺激效应。同Ca2+一样，OAG可对抗谷胱甘肽过氧化物酶对5-LO活性的抑制［10］。CLP是结合蛋白中的一员，CLP与5-LO的结合绑定需在完整的细胞中发生，5-LO与F-肌动蛋白相竞争与CLP相结合。CLP可以上调激动5-LO活性［11］。当无PC时，CLP可以替代PC激活5-LO，当CLP和PC同时存在时可以提高5-LO的活性，这是通过色氨酸残基与5-LO的配体结合环相结合，即蛋白的相互作用实现的。实验发现，CLP、5-LO以静息状态存在于胞质区域，给予Ca2+载体刺激后，5-LO、CLP转位到细胞核区域，因此，没有Ca2+，CLP依然可以绑定5-LO，但需要Ca2+才能激活5-LO［12］。

1.75-LO激动蛋白 （5-lipoxygenase actin protein，FLAP）FLAP相对分子质量约为18×103，包含2个亲水环和3个跨膜区，主要分布在细胞核膜或内质网膜上。缺乏FLAP或给予FLAP抑制剂，5-LO就不能将内源性的AA催化生成LTA4，因此，FLAP是激活5-LO所必需的。一些观点认为，FLAP除了能为5-LO与膜结合提供位点，还作为转移蛋白结合AA，呈递给5-LO。FLAP能增强5-LO的生物活性［13］。

1.85-LO的磷酸化5-LO的氨基酸序列包含有几个蛋白激酶的序列，5-LO的磷酸化受到激酶A（PKA）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）调节的MAPKAPK-2/3、ERK1/2的调节。给予细胞刺激（如细胞应激、佛波醇酯），激活MAPKAPKs和ERKs诱导Ser271或Ser663磷酸化，促使5-LO异位，提高5-LO的活性，但易被蛋白激酶抑制剂所抑制［14］。细胞中，磷酸化的5-LO在很低的Ca2+浓度即可激活5-LO活性［15］。当5-LO中Ser271或Ser663突变为丙氨酸时，5-LO被p38MAP KAPK磷酸化明显减少；外源性的腺苷和cAMP可激活PKA诱导Ser523磷酸化，细胞外和细胞内的5-LO活性均可直接抑制［14］。AA和油酸可以促进Ser271、Ser663磷酸化，同时抑制Ser523磷酸化，使5-LO活性增加，提高5-LO产物的合成［16］。

2　5-LO及其产物抑制剂

为了干预5-LO的活性及其产物的合成，5-LO及其产物抑制剂主要从以下3个途径抑制：抑制cPLA2酶、FLAP抑制剂及直接抑制5-LO。

2.1cPLA2酶抑制剂cPLA2酶抑制剂，如糖皮质激素可抑制所有类花生酸的形成，cPLA2基因敲除小鼠也能抑制类花生酸合成。尽管实验中糖皮质激素可明显减少类花生酸，但在临床研究中，cPLA2酶抑制剂对抑制LTs生成是无效的。有研究结果显示，选择性cPLA2酶抑制剂虽然对关节炎［17］、急性肺损伤［18］和（或）缺血再灌注损伤［19］的实验动物模型有一定的治疗作用，但不能完全降低LTs水平。

2.2FLAP抑制剂FLAP抑制剂即通过拮抗FLAP，干扰其结合底物AA呈递给5-LO，并且干扰5-LO与FLAP定位结合。在完整的细胞内FLAP抑制剂能抑制5-LO的活性，尤其在AA是内源性的［20］。相反，如果AA是外源性的就会损伤其功效。FLAP抑制剂对提纯的5-LO不能抑制其产物生成。虽然FLAP抑制剂MK886、Bay-X 1005或MK0591对分离的白细胞有效，但是在血液化验中，药效要弱50～200倍，可能由于血浆中其他蛋白竞争绑定药物或AA。研究发现，FLAP抑制剂AM103是一种强有效的和选择性FLAP抑制剂，在体内具有卓越的药效性能，对急、慢性炎症和休克动物模型均有效［21］。FLAP抑制剂AM803是一种吲哚衍生物，目前已完成临床治疗哮喘第二阶段的部分研究，有望进入临床使用［22-23］。

2.35-LO直接抑制剂

2.3.1抗氧化/游离基清除抑制剂这类抑制剂包括许多天然植物提取物（如咖啡酸、黄酮类、香豆素类等）及合成物（如AA-861、BW755C），这些药物使催化中心的铁离子始终保持在Fe2+状态，不能进入循环，从而抑制5-LO活性。它们均是5-LO的高效抑制剂，但缺乏合适的口服生物利用度，因为这类抑制剂非特异性地抑制了体内普遍存在的氧化还原系统或活性自由基，导致高铁血红蛋白血症等严重不良反应，从而阻止这类药物的广泛运用，发展缓慢。

2.3.2铁配位体抑制剂铁配位体抑制剂代表异羟肟酸或N-羟基脲衍生物，其不仅可螯合催化中心的铁离子，还具有较微弱的还原性能力，其代表药物Zileuton，有效的高选择性5-LO抑制剂，半衰期为2.5 h，清除率为7.0mL/（min·kg），主要代谢途径为N-羟基脲基团的葡萄糖醛酸化。Zileuton（IC50=0.5～1.0μm）可改善急性或慢性哮喘患者的气道功能，减少β受体激动剂或糖皮质激素的用量，但作为美国唯一批准上市的5-LO抑制剂，其用于治疗过敏性鼻炎、类风湿关节炎的疗效一般。VIA-2291已完成动脉粥样硬化和心血管疾病的二期临床试验，有可能在临床应用［24］。将VIA-2291的结构优化后得到ABT-761，在支气管痉挛的动物模型上其作用强于Zileuton4～5倍，半衰期为16h，但其临床应用还有待开发。

2.3.3非氧化还原抑制剂非氧化还原抑制剂拥有与5-LO的自然底物不饱和脂肪酸类似结构，从而与AA 或LOOH竞争结合5-LO，它们经5-LO催化主要生成的代谢产物LTB5的生物活性仅为LTB4的1%。模拟底物抑制剂分子结构不同，本身缺乏氧化还原性能力，但却不能排除其能改变5-LO的氧化还原状态。其代表药物有ZD2138、ZM230487属于甲氧基四氢吡喃，该类药物升高过氧化物浓度和（或）升高MAPKAPK-2/3、ERK1/2调控的5-LO磷酸化水平，可影响药物对5-LO的抑制作用［25］。CJ-13610属于咪唑类5-LO抑制剂，研究显示，CJ-13610有很好的止痛效果，且不受5-LO磷酸化激活状态的干扰，能更好地应用于哮喘、癌症等疾病［26］。

3　小　结

5-LO及其代谢产物参与了许多疾病的发生、发展过程，了解5-LO活性的调节及其抑制，对5-LO相关疾病的研究有着重要作用。目前，对5-LO活性调节的了解是有限的，5-LO抑制剂也存在着毒性反应大、特异性低等问题，但相信不久的将来，有待研制出低毒、高效的5-LO抑制剂，造福人类的健康事业。

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国家自然科学基金资助项目（30900606）。

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2015-05-25

2015-11-15）