葡萄相关酵母多样性及其菌种鉴定的研究进展

李 婧,罗苏苏,张晓旭

(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121000;2.大连理工大学生物科学与技术学院,辽宁大连 116024)

葡萄相关酵母多样性及其菌种鉴定的研究进展

李 婧1,2,罗苏苏1,+,张晓旭1

(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121000;2.大连理工大学生物科学与技术学院,辽宁大连 116024)

本文对葡萄相关酵母菌种的种类及其多样性、酵母菌群在不同环境和酿造过程中的动态变化以及传统和现代菌种鉴定方法的特点等方面进行综合阐述,为筛选具有地域特征、发酵性能良好的野生酵母菌种提供了一定的理论依据。

葡萄相关酵母,菌种鉴定,多样性

葡萄相关酵母是指广泛存在于葡萄园土壤、葡萄浆果表面、葡萄酒、酒厂环境、设备表面以及发酵罐内部残留物中的酵母[1]。研究不同产区中葡萄相关酵母多样性,有助于酒厂筛选出具有区域特色性的优良原生酵母,赋予葡萄酒复杂、多样的风味,提高葡萄酒品质等目的。目前,多采用传统菌株鉴定方法和现代分子分类学法相结合进行菌种鉴定。本文综述了葡萄相关酵母菌种的种类及其多样性,酵母菌群在不同环境和酿造过程中的动态变化,以及常用菌种鉴定方法的优缺点。

1 葡萄相关酵母的种类及作用

葡萄酒酿造过程的本质是酵母菌、乳酸菌、霉菌等微生物代谢活动的过程,使葡萄酒的香气和风味表现得复杂和多样[2]。酵母菌是引起葡萄酒发酵的必备条件[3],在酿造过程中起主导作用,对葡萄酒的香味、酒度、色泽、品质等都有重要影响[4]。迄今为止,发现与葡萄酒相关的酵母菌共有18个属,70多个种[5]。在这些相关酵母菌中,酿酒酵母(Saccharomyces)在葡萄酒发酵过程中起主导作用,它不仅可以通过代谢活动产生多种香气活性化合物,如醇类、酯类、硫化物、挥发酸、挥发酚等,而且还能释放葡萄中的一些非香型前体物质,产生挥发性香气物质[6]。此外,酿酒酵母还可吸附葡萄汁组分[2],如吸附葡萄汁中的花色苷,从而对葡萄酒的外观品质产生影响[7]。

除了酿酒酵母,还有非酿酒酵母属(non-Saccharomyces),包括梅氏酵母属(Metschnikowia)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、汉生酵母属(Hansenula)、酒香酵母属(Brettanomyces)、克勒克酵母属(Kloeckera)、假丝酵母属(Candida)、裂殖酵母属(Schizosacharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)等[8]。非酿酒酵母酒精耐受力较差,产醇能力不如酿酒酵母,但是非酿酒酵母比酿酒酵母能产生更多的甘油、琥珀酸、醋酸和酯类。其中,星形假丝酵母(Candidastellata)可以产生大量的甘油、琥珀酸和醋酸,不仅赋予葡萄酒柔和性、圆润感和粘稠度,而且使葡萄酒具有强烈的蜂蜜、杏、和乙酸乙酯香。柠檬克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)也可以产生大量的甘油,同时也可产生大量的酯类,产酯高的酵母还包括有孢汉逊酵母、异常汉逊酵母、毕赤酵母和异常毕赤酵母。酒香酵母既可以产生水果香和咖啡香,也可以产生鼠尿和药的苦味,其代谢物若少量存在会增加葡萄酒的复杂感,过多则会破坏酒的风味[8]。因此,非酿酒酵母在一定程度上能够提高葡萄酒结构、香气和风味的复杂性。

产生高级醇、酯、有机酸、挥发性酚类的非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵不仅可以改善葡萄酒的风味、赋予葡萄酒复杂多样的香气与多层次的结构,而且在发酵后一起耗尽酒中的主要营养成分和生长因子,在一定程度上防止了进一步污染[9]。

2 葡萄相关酵母的多样性

2.1 不同来源酿酒葡萄相关酵母多样性

目前,从葡萄浆果表面分离出的酵母菌主要有隐球酵母属(Cryptococcus)和毕赤酵母属(Pichia)。卢君[10]对沙城产区龙眼葡萄进行了研究,从成熟的葡萄浆果表面分离出了假丝酵母、隐球酵母、红酵母(Rhodutorula)和少量的类似酵母菌的出芽短梗霉,还分离出了毕赤酵母和克勒克酵母。Cédric Grangeteau等[11]人对法国勃艮第地区霞多丽葡萄种植区进行了研究,从葡萄浆果上面分离出8个属140种酵母,主要为隐球酵母,还有少量毕赤酵母和丝孢酵母属(Trichosporon),酿酒酵母很稀少。研究表明,葡萄浆果上面的酵母组成由很多因素决定,与葡萄园的地理位置、土壤的种类、葡萄品种等有关,一些酵母能非常适宜特定的气候条件,在一年又一年的自然选择中逐渐成为该葡萄园的优势菌种[12]。土壤种类、葡萄品种和产地对酵母菌的具体影响还需进一步研究。

葡萄汁中的酵母种类与浆果表皮不一样,从葡萄汁中分离出的酵母菌主要属于有孢汉逊酵母属和梅氏酵母属。Martin Seidel[13]对德国两个葡萄酒产区酵母菌多样性进行了研究,结果表明从葡萄汁中分离出的酵母菌株主要属于有孢汉逊酵母和梅氏酵母。Cédric Grangeteau等[11]人从葡萄汁里面分离出来4个属的酵母,主要为有孢汉逊酵母、梅氏酵母和毕赤酵母,8%为酿酒酵母。葡萄汁中的酵母种类与浆果表面的酵母种类有很大差异,浆果表面富含的隐球酵母并未在葡萄汁中分离出,说明隐球酵母不能在葡萄汁中存活,可能因为有孢汉逊酵母和梅氏酵母抑制其生长,也可能因为它不能适应葡萄汁的pH,这需要进一步研究。

从酿酒设备上面也能分离出酵母菌,主要属于有孢汉逊酵母属。徐艳文等[14]人对甘肃莫高葡萄酒厂酿酒设备表面的酵母菌进行了研究,分离出的酵母菌主要属于有孢汉逊酵母属和红酵母属。Cédric Grangeteau等[11]人对法国勃艮第地区霞多丽葡萄种植区进行了研究,从酿酒设备上共分离出了7个属的酵母,主要为有孢汉逊酵母和隐球酵母。从酿酒设备上面分离出的酵母都可以从葡萄浆果表面和葡萄汁中分离,这说明酿酒设备上面的酵母来源于葡萄浆果表面和葡萄汁。

2.2 不同发酵时期酵母菌种群的变化

发酵前期,非酿酒酵母占据主导地位,主要为梅氏酵母、有孢汉逊酵母、假丝酵母和毕赤酵母,酿酒酵母极少。郭晶晶等[15]人对杨凌赤霞珠葡萄自然发酵酵母菌的动态变化进行了研究,从发酵前期的葡萄汁中分离出的酵母菌,以有孢汉逊酵母和梅氏酵母为主,还有少量的毕赤克鲁维酵母(Pichiakluyvori)和酿酒酵母。Cecile Miot-Sertier等[16]人对波尔多地区葡萄酒酿造初始阶段中非酿酒酵母的动态与多样性进行了研究,葡萄酒发酵前4 d中都是非酿酒酵母居于主导地位,第5 d酿酒酵母才开始增长,发酵前期以有孢汉逊酵母和梅氏酵母为主,假丝酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母和伊萨酵母(Issatchenkia)也大量存在,而酿酒酵母极少。Cédric Grangeteau等[11]人对法国勃艮第地区霞多丽葡萄种植区进行了研究,从发酵初期的葡萄汁中分离出的酵母,主要为梅氏酵母和有孢汉逊酵母,少量的毕赤酵母,酿酒酵母只占8%;在发酵初始阶段,有孢汉逊酵母数量逐渐增加,但当酒精含量快达到5.1%时,其数量减少,菌株比例很低。随着发酵的进行,酒精耐受力更强的酿酒酵母大量增加并且几乎限制了所有的非酿酒酵母的生长与活性[17]。发酵前期分离出的酿酒酵母极少,非酿酒酵母大量存在,酒精发酵可能是由非酿酒酵母启动,这还需进一步研究确定。

发酵中期,酿酒酵母占据主导地位,非酿酒酵母少量存在,如有孢汉逊酵母、梅氏酵母和克鲁维酵母。郭晶晶等[15]人对杨凌赤霞珠葡萄自然发酵酵母菌的动态变化进行了研究,从发酵中期的葡萄汁中分离出了酿酒酵母、有孢汉逊酵母、美极梅氏酵母、东方伊萨酵母和佛罗伦萨接合酵母,分别占该时期筛选酵母的81.86%、16.27%、0.93%、0.47%、0.47%。宋育阳等[18]人对宁夏御马葡萄酒厂的神索葡萄自然发酵酵母菌群进行了研究,从发酵中期分离出来酿酒酵母和有孢汉逊酵母,分别占该时期的96.1%和3.9%。Cédric Grangeteau等[11]人从发酵中期的葡萄酒中分离出了酿酒酵母和克鲁维酵母,而克鲁维酵母占比低于9%。发酵中期,葡萄酒的酒精浓度上升,大部分非酿酒酵母已经不能存活了,而有孢汉逊酵母、梅氏酵母和克鲁维酵母仍可分离出,说明它们的酒精耐受力比较好。

在发酵后期,只能分离出酿酒酵母[7,15,18]。此时,酒精浓度高,只有酒精耐受力好的酿酒酵母存活下来,其他的非酿酒酵母没有分离出,这可能是因为非酿酒酵母都不能在此时的酒精浓度条件下存活,也可能是酿酒酵母完全抑制了非酿酒酵母的生长,这需要对发酵中期分离出的非酿酒酵母进行酒精耐受力实验,进而确定。

3 酵母菌株的鉴定方法

3.1 传统菌株鉴定方法

传统的酵母菌分类方法主要建立在常规分类基础上,根据表型性状来鉴定;研究表明酵母菌的某些表型性状稳定性差,在长期保藏菌株或经多次转接后某些性状会有所改变[7]。而且,经过形态观察和生理生化实验,还需要再查索引表来确定所测菌株的种属,这需要大量的重复性实验,操作繁琐、工作量大、周期较长。不仅如此,只要实验条件稍有变化,就会影响实验的重现性,大多数菌株的形态特征简单,但其种类很多、分类较广,所以难以精确判定[19]。

3.2 现代分子分类鉴定法

传统的酿酒葡萄相关酵母的研究主要采用常规的培养方法,通过表型和生理生化特征来鉴定酵母菌的种类,但是一些酵母菌是不可培养的,因此,常规培养方法缺乏对酵母菌的系统和全面的研究。而现代分子技术不需要对样品中微生物进行分离培养,能够快速检测大量的不能培养的微生物且工作量小、重现性高[20]。近年来,随着分子生物学的发展而产生了很多鉴定酵母菌的新方法,其中,主要有:宏基因组学[20]、高通量测序技术[21-22]、26S rDNA D1/D2 区序列分析[7,11,23-27]、5.8S-ITS rDNA区域序列分析[7,10,24,28-30]、26S rDNA-RFLP分析[31]、Interdelta指纹图谱分析[32-35]、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)[11,32]、变性梯度凝胶电泳(DGGE)[22,36]等。

随着现代核酸自动化扩增技术的发展,DNA序列分析广泛应用于葡萄酒相关酵母菌的鉴定。研究表明,26S rDNA D1/D2区域具有比较高的变异性,不同种的菌株26S rDNA D1/D2区核苷酸替换率很大,而同种内不同菌株之间核苷酸替换率一般不会超过1%,所以,26S rDNA D1/D2区序列分析能够鉴定到种级水平[7,26-27]。转录间区(ITS区)也具有较高的变异性,可以用于亲缘关系比较近的菌株之间的分析,5.8S-ITS rDNA区域序列分析法鉴定葡萄相关酵母的快速准确性已被验证[7,24]。目前,大多数酵母菌的26S rDNA的D1/D2区、5.8S rDNA和ITS的序列已经被提交在国际核酸序列数据库中,通过对特定基因区域的查找和序列比对能够准确地对葡萄相关酵母进行分类鉴定。26S rDNA D1/D2区序列分析与5.8S-ITS rDNA区域序列分析为目前最常用的DNA序列分析法。但针对个别酵母菌种使用这两种方法之一仍不能确定到种,需要另一种方法来进一步确定。这两种方法与RFLP技术相结合则会更加简便,而且可将绝大部分非酿酒酵母的菌株区分开来[7,31]。

Interdella序列在酿酒酵母中分布广泛,Interdelta指纹图谱分析方法能准确地将酿酒酵母菌株区分至亚种水平,该方法具有简单快速、操作容易、扩增条带图谱稳定等优点[32,34]。黄英子等[33]人对甘肃地区美乐冰红自然和接种发酵分离出的343株酿酒酵母进行了Interdelta指纹图谱分析,区分为7个亚种;对甘肃地区贵人香冰白自然和接种发酵分离出的625株酿酒酵母进行了Interdelta指纹图谱分析,区分为18亚种;通过聚类分析可以确定不同亚种酿酒酵母之间的亲缘关系,使其分类更接近于自然分类系统。赵晶晶等[34]人对沙城产区龙眼葡萄相关酵母菌进行研究,利用Interdelta指纹图谱分析技术将分离得到的54株酿酒酵母区分为4个亚种。R Romaniello等[35]人对来自意大利英雄葡萄种植区(heroic vine-growing area)自然发酵葡萄酒中的酿酒酵母菌进行了研究,利用Interdelta指纹图谱分析技术将分离得到的39株酿酒酵母区分为4个亚种。

与DNA指纹图谱技术相比,宏基因组学技术可以获得研究样品中所有微生物的全基因组序列信息,借助高通量测序技术可以发现大量不可培养的微生物,有助于了解微生物菌落结构[20]。高通量测序技术可直接准确分析出样品微生物组成,不需要进行分离、纯化及培养[21]。而且它还具有分析样品量多、单个样品序列通量高的优点,主要应用于土壤微生物研究中[22]。

目前,DNA序列分析法是葡萄相关酵母现代分子鉴定方法中应用最广的,而对于酿酒酵母则会进一步进行Interdelta指纹图谱分析。通过宏基因组学技术,可以获取样品中所有酵母菌的基因组序列信息。高通量测序技术不仅可用于葡萄园土壤中酵母菌结构组成的研究,也可分析葡萄酒中微生物的构成。

4 展望

国外不同葡萄酒产区都利用自己独有的酵母菌进行酿造,具有鲜明的特色性,而国内的葡萄酒厂多购买进口商业酵母进行酿造,缺乏自己的特色。随着科学技术的不断进步,研究手段更加先进,能更好地了解不同地区的酵母多样性,从而为筛选不同地域的优良野生酵母做好准备。

对筛选出来的酵母菌我们可以进一步分析其代谢产物对葡萄酒香气、风味的影响,以及它的酿造性能。进一步筛选出酿造性能良好且有利于形成良好香气和风味的优良野生酵母菌,然后进行葡萄酒酿造实验。可接种单一野生酵母或者几株野生酵母,也可接种野生酵母和商业酵母一起酿造,最终确定最佳方案投入生产。这不仅有利于我国不同地区生产特色风格的葡萄酒,还能提高产品的品质,增强我国葡萄酒在世界的竞争力。

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Research progress on diversity and identification of grape-related yeast species

LI Jing1,2,LUO Su-su1,+,ZHANG Xiao-xu1

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou121000,China;2.College of Biological Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian116024,China)

In this paper,grape-related yeast species and diversity,dynamic change of yeast in different environment and brewing process,characteristics of traditional and modern for identification of strains were comprehensively reviewed.It provide certain theoretical basis for the selection of wild yeast strains with regional characterisrics and good fermentation performance.

grape-related yeast;strain identification;diversity

2016-04-14 +同为第一作者。

李婧(1980-)，女，博士研究生，副教授，研究方向：食品微生物与发酵，E-mail:lijing80@mail.dlut.edu.cn。 罗苏苏(1995-)，女，大学本科，研究方向：食品科学，E-mail:losusu36@163.com。

辽宁省大学生创新项目。

TS261.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000