金银花提取物对中波紫外线辐射致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用

杨明建,郑 燕,陈建中,申海玉,张 浩,韩孟丽,刘志梅

(1.邯郸学院生命科学与工程学院,河北邯郸 056005;2.邯郸学院数理学院,河北邯郸 056005)

金银花提取物对中波紫外线辐射致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用

杨明建1,郑 燕2,陈建中1,申海玉1,张 浩1,韩孟丽1,刘志梅1

(1.邯郸学院生命科学与工程学院,河北邯郸 056005;2.邯郸学院数理学院,河北邯郸 056005)

研究金银花提取物对中波紫外线(UVB)辐射致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用。将60只雄性小鼠随机分为6组,分别为空白对照组、金银花提取物单独处理组、辐射模型组、金银花提取物低、中、高剂量处理组。其中金银花提取物单独处理组和低、中、高剂量组每天上午灌胃400、200、400和600 mg·kg-1·d-1的金银花提取物,空白和辐射模型组灌胃生理盐水,除空白和金银花提取物单独处理组外,其余4组均在下午接受3 h的UVB(285 nm)照射。实验处理30 d后,测定各组小鼠睾体比、精子活率、睾丸组织病理学变化及超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量。结果表明,与空白对照组相比,辐射模型组小鼠睾体比和精子活率均显著下降(p<0.05),睾丸曲细精管生精上皮排列疏松,可见生精细胞脱落至管腔,睾丸组织SOD活性显著降低而MDA含量显著升高(p<0.01)。与辐射模型组相比,金银花提取物低、中、高剂量处理组小鼠睾体比和精子活率均显著升高(p<0.05),生精上皮排列越来越致密,睾丸组织SOD活性显著增加而MDA含量显著下降(p<0.01),并且呈现良好的剂量-效应关系。以上结果表明,金银花提取物对UVB辐射致雄性小鼠生殖系统损伤有一定的保护作用。

中波紫外线,金银花提取物,生殖系统,超氧化物歧化酶,丙二醛

随着现代工业的发展,环境问题日益突出,导致大气中臭氧层受破坏的程度逐年升高,阳光中到达地面的紫外线逐渐增加,由于累积效应引起的辐射生物学损伤也越来越严重[1]。根据紫外线的生物学效应可将其分为长波紫外线(UVA)、中波紫外线(UVB)和短波紫外线(UVC),由于能够到达地球地面的UVB的杀伤力较UVA更强,研究UVB辐射对生物体的损伤具有十分重要的意义。大量研究证实,过量的UVB暴露能够引起皮肤、角膜、视网膜的光老化及免疫系统抑制等[2-5]。如何防治紫外线辐射损伤,寻找天然、高效、稳定、低毒乃至无毒的抗辐射制剂和自由基清除剂已成为生命科学和医学工作者共同关注的热点问题。近年来的研究发现,UVB辐射能够造成雄性小鼠生殖系统的损伤[6],引起雄性小鼠增重减慢、睾体比降低、精子活率下降、睾丸组织病变、SOD 活性降低和MDA含量增加,但对精子畸形率影响不大。

研究表明,三七皂苷、茶多酚、枸杞多糖等天然植物化合物都具有较强的抗辐射能力[7-12],以天然植物为原料研究和开发抗辐射保健食品具有十分广阔的前景。金银花是由忍冬科植物金银花(Lonicera japonica)的花蕾及初开的花干制所得,2002年被原卫生部列入第一批《按照传统既是食品又是中药材物质目录》。大量研究证实,金银花提取物含有绿原酸、异绿原酸、木犀草素、挥发油、总黄酮、三萜皂苷等多种对人体有益的生物活性物质,具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎抑菌、抗氧化、清除自由基、保肝利胆和提高机体免疫力等多种活性功能[13-19],但金银花提取物对UVB辐射致雄性小鼠生殖系统损伤的影响在国内外都鲜见报道。本研究通过测定不同剂量金银花提取物对受UVB照射小鼠增重、睾体比、精子活率、睾丸组织病理学变化以及SOD活力和MDA含量等指标的变化,评价金银花提取物对UVB辐射致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用,以期为金银花类保健食品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

含20%绿原酸的纯天然金银花提取物 西安瑞林生物科技有限公司;超氧化物歧化酶、丙二醛、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;硫化钠、乙酸、无水乙醇、甲醇、二甲苯、苏木精、伊红、盐酸乙酸、蛋白胶 均为分析纯;清洁级、昆明种雄性小鼠 60只,体重20.1～24.3 g,购于河北医科大学实验动物学部,使用许可证号:SYXK(冀)2009-0045,生产许可证号:SCXK(冀)2008-1-003。

紫外诱变超净工作台 济南杰康净化设备厂;紫外线强度测量仪 北京同德创业科技有限公司;石蜡切片机 德国LEICA公司;CX31型光学生物显微镜 日本OLYMPUS公司;721分光光度计 上海欣茂仪器有限公司;TGL-16B型台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂;DY89-Ⅰ型电动玻璃匀浆器 宁波新芝科学器材研究所;超级恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 UVB辐射模型建立与小鼠分组 UVB辐射模型的建立参考已发表论文并做适当修改[6]。60只雄性小鼠随机分为6组(每组10只),分别为空白对照组、金银花提取物单独处理组、辐射模型组、金银花提取物低、中、高剂量处理组。金银花提取物的灌胃剂量参考已发表的论文[15],其中金银花提取物单独处理组每天上午灌胃400 mg·kg-1·d-1的金银花提取物;金银花提取物低、中、高剂量处理组每天上午分别灌胃200、400和600 mg·kg-1·d-1的金银花提取物;空白和辐射模型组灌胃生理盐水;除空白和金银花提取物单独处理组外,其余4组小鼠均在下午接受3 h的UVB(285 nm)照射,照射强度为1.5 mW/cm2,UVB辐照剂量累计为13.1 J/cm2,连续处理30 d。

1.2.2 标本采集与指标检测

1.2.2.1 小鼠体重、睾丸重量与睾体比测定 将各组小鼠称体重后采用断脊髓法处死,立即解剖并取出双侧睾丸,生理盐水冲洗,分离睾丸上的附睾备用,称取睾丸的重量,并计算睾体比(g/100 g)。

1.2.2.2 小鼠附睾精子活率测定 剪开阴囊,从睾丸两侧分离附睾,放入盛有生理盐水的小烧杯,生理盐水的温度要保持在37 ℃ 5 min,剪碎附睾,使溢出的精子充分混匀制成精子悬浊液。取一滴精子悬液滴于载玻片上,推成薄片,自然晾干后加入甲醇中固定5 min。晾干后,将涂片放入1%伊红染液中染色1 h,用蒸馏水充分洗涤后,自然晾干,进行显微观察,每只小鼠检查完整不重叠的精子1000条,计算精子活率。

1.2.2.3 睾丸组织病理学检查 获得睾丸标本后,用布氏液固定,常规石蜡包埋切片,苏木精-伊红染色,显微镜下观察。

1.2.2.4 小鼠睾丸组织SOD活力和MDA含量的测定 取右侧睾丸标本,制备10%的组织匀浆,按照试剂盒产品说明书中的操作流程测定睾丸组织中SOD活性和MDA含量。

表1 各组小鼠增重、睾丸重量和睾体比

注:与空白对照组相比,*p<0.05,**p<0.01;与辐射模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;表2、表3同。2 结果与分析

2.1 各组小鼠增重、睾丸重量和睾体比的变化

实验过程中,除辐射对照组小鼠死亡2只,金银花提取物低剂量组死亡1只以外,其余各组小鼠均存活。由表1可知,与空白对照组相比,辐射模型组小鼠增重、睾丸重量和睾体比均显著降低(p<0.05),表明UVB辐射能够显著降低小鼠体重的增长速度,引起睾丸重量和睾体比的下降;金银花提取物单独处理组小鼠睾体比显著升高(p<0.05),小鼠增重和睾丸重量变化不显著(p>0.05),说明金银花提取物本身具有升高睾体比的作用;与辐射模型组相比,金银花提取物低、中、高剂量处理组小鼠增重、睾丸重量和睾体比均显著升高(p<0.05),且呈现良好的剂量-效应关系。以上结果表明,不同剂量金银花提取物能够显著抑制UVB辐射处理引发的小鼠增重、睾丸质量和睾体比的下降,改善UVB辐射对小鼠机体和睾丸造成的损伤。

2.2 各组小鼠附睾精子活率的变化

由表2可知,与空白对照组相比,辐射模型组小鼠精子活率显著降低(p<0.05),而金银花提取物单独处理组小鼠精子活率变化不显著(p>0.05),说明UVB辐射能够导致雄性小鼠生殖损伤,而金银花提取物本身对小鼠精子活率无显著影响;与辐射模型组相比,金银花提取物低、中、高剂量组小鼠精子活率均显著升高(p<0.05),而且呈现良好的剂量-效应关系,说明金银花提取物对辐射处理引发精子活率的下降有改善作用。

表2 金银花提取物对辐射处理引发精子活率下降的改善作用

2.3 各组小鼠睾丸组织病理学变化

由图1(A)可见,空白对照组小鼠睾丸曲细精管生精上皮管壁完整,由基底面到管腔面各层生精细胞排列致密,层次鲜明;金银花提取物单独处理组与空白对照组类似(图1B)。由图1(C)可见,辐射模型组小鼠曲细精管管壁出现裂痕,生精上皮层次紊乱,大量生精细胞脱落至管腔,说明UVB辐射能够造成小鼠睾丸曲细精管生精上皮和生精细胞的损伤。金银花提取物低剂量组小鼠睾丸曲细精管生精上皮排列疏松,层次不鲜明,亦可以看到少量生精细胞脱落至管腔(图1D);图1(E)为金银花提取物中剂量组小鼠生精上皮排列越来越致密,层次越来越鲜明,未见脱落的生精细胞(图1E);金银花提取物高剂量组小鼠生精细胞层次更加致密和整齐(图1F)。以上结果表明,金银花提取物能够改善UVB辐射诱发的睾丸组织病理学损伤,维持生精上皮的完整性。

图1 各组睾丸组织病理学变化(400×)Fig.1 Histopathological changes in testis of mice in each group(400×)注:A:空白对照组;B:金银花提取物单独处理组;C:辐射模型组;D:金银花提取物低剂量组;E:金银花提取物中剂量组;F:金银花提取物高剂量组。

2.4 各组小鼠睾丸组织SOD活力和MDA含量的变化

SOD是一种抗氧化酶,其活力高低可间接反映机体对自由基的清除能力;MDA是脂质过氧化的最终产物,是机体氧化应激的重要指标[19-20]。由表3可知,与空白对照组相比,辐射模型组小鼠睾丸组织SOD活力极显著降低(p<0.01),而MDA含量极显著增加(p<0.01),说明UVB辐射能够引发小鼠发生氧化应激。与空白对照组相比,金银花单独处理组小鼠睾丸组织SOD活力显著升高(p<0.05),而MDA含量显著降低(p<0.05),说明金银花提取物单独处理可以显著增强小鼠的抗氧化能力;与辐射模型组相比,金银花提取物低、中、高剂量组睾丸组织SOD活力极显著升高(p<0.01),而MDA含量极显著降低(p<0.01),说明金银花提取物能够通过增强小鼠抗氧化能力来降低由UVB辐射引发的小鼠氧化应激。

表3 各组小鼠睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量

3 结论

本研究发现金银花提取物能够显著抑制UVB辐射处理所致的雄性小鼠增重、睾丸质量和睾体比的下降,明显改善UVB辐射所致的精子活率下降和睾丸组织病理学损伤,并维持曲细精管生精上皮的完整性。此外,金银花提取物还能够通过显著升高睾丸组织SOD活力来增强小鼠的抗氧化能力,通过降低MDA含量来改善UVB辐射所致的小鼠氧化损伤,并且呈现良好的剂量-效应关系,在高剂量下未呈现毒副作用。以上研究结果表明,金银花提取物在抗辐射保健食品的开发方面具有很大的潜力,本实验针对金银花提取物对UVB辐射所致雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用进行评价,但其具有抗辐射活性的主要有效成分尚不十分清楚,防护机理也有待进一步研究。

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Protective effects of honeysuckle extract against the uvb-induced radiation damage to reproductive system in male mice

YANG Ming-jian1,ZHENG Yan2,CHEN Jian-zhong1,SHEN Hai-yu1, ZHANG Hao1,HAN Meng-li1,LIU Zhi-mei1

(1.College of Life Science and Engineering,Handan College,Handan 056005,China; 2.College of Mathematics and Physics,Handan College,Handan 056005,China)

The aim of this study was to investigate the protective effects of honeysuckle extract against the Ultraviolet B(UVB)-induced radiation damage to reproductive system in male mice. Sixty male mice were randomly divided into 6 groups,the blank control group,the honeysuckle extract single treatment group,the radiation model group and the honeysuckle extract low,middle,high dosage-treated groups. The mice in honeysuckle extract single treatment group and low,middle,high dosage-treated groups were given 400,200,400 and 600 mg·kg-1·d-1honeysuckle extract by intragastric administration respectively. The blank control and radiation model group were given normal saline. The mice were all given orally in the morning. The rest of the four groups were given 3 hours of UVB(285 nm)radiation in the afternoon except the blank control and honeysuckle extract single treatment group. After 30 days,the testis to body ratio,sperm motility rates,histopathological changes in testis,the SOD activity and MDA content of testicular tissue were determined. When compared to the blank control group,the,testis to body ratio and sperm motility rates of mice in the radiation model group declined significantly(p<0.05). The spermatogenic epitheliums were loosely-arranged and spermatogenic cells were fell into the tubules,the SOD activity degraded and MDA content raised significantly as well(p<0.01). The testis to body ratio,SOD activity increased,MDA content decreased significantly in the honeysuckle extract single treatment group(p<0.05). Compared to the radiation model group,with the increase of honeysuckle extract dosage,the testis to body ratio and the sperm motility rates in the honeysuckle extract-treated groups raised significantly(p<0.05),the spermatogenic epitheliums were more and more impact,the SOD activity raised and the MDA content of testicular tissue degraded notably(p<0.01),and all these changes showed obvious dose-effect relationship. The results suggest that honeysuckle extract has protective effects against the UVB-induced radiation damage to reproductive system in male mice.

Ultraviolet B;honeysuckle extract;reproductive system;SOD;MDA

2016-06-15

杨明建(1981-),男,硕士,副教授,研究方向:天然食药植物活性物质检测与研发,E-mail:yangmingjian107@126.com。

河北省科技计划项目(12272502);邯郸市科学技术研究与发展计划项目(1422104057-2、1323108093-9、0821107050-2)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000