副溶血弧菌快速检测技术研究进展

郭 钦,陈 会,徐海堂,严 冬,何宇轩,候昭志

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

副溶血弧菌快速检测技术研究进展

郭 钦,陈 会,徐海堂,严 冬,何宇轩,候昭志

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

副溶血弧菌是一种重要的嗜盐性食源性致病菌,广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼虾、贝类等海洋生物中。在我国沿海地区,由副溶血弧菌引起的食物中毒已成为微生物中毒的首要因素。本文分别以副溶血弧菌菌体、核酸、蛋白质和代谢产物为检测对象,介绍了各种PCR技术、酶联免疫吸附技术和生物传感器技术等目前副溶血弧菌的热点快速检测技术,对各种技术进行了比较分析,并对未来的发展前景作了展望。

副溶血弧菌,食源性致病菌,快速检测技术

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌,以鱼、虾、贝类等海产品为主要传播载体[1]。人们食用未煮熟或被副溶血弧菌污染的海产品,可引起腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发烧等典型肠胃炎反应,严重时甚至会危及生命安全。副溶血弧菌的主要毒力因子有不耐热溶血毒素(TLH)、耐热直接溶血素(TDH)和耐热相关溶血素(TRH)。研究表明,TLH是一种非典型的磷脂酶,能溶解人和马的红细胞,具有副溶血性弧菌种属的特异性。TDH能在我妻氏血平板上引起β-溶血(神奈川现象),具有致死毒性、心脏毒性、细胞毒性和肠毒素作用;TRH虽不能引起神奈川现象,但其与TDH有相似的免疫原性和67%的相同氨基酸序列,并同样具有致死作用和细胞毒性。我国食源性疾病监测网调查了其监测地区(16个省)14年间8千余起食物中毒案例,发现微生物性病原仍然是我国食源性疾病的主要病因(占30%～40%)。近十年来,由交叉污染导致肉类食品或生食水产品(包括淡水鱼污染)而引起的副溶血性弧菌食物中毒已取代沙门氏菌,跃居第一位。因此,迫切的需要一种快速、简便、经济、安全、准确的检测方法对副溶血弧菌进行实时监控。本文分别以副溶血弧菌菌体、蛋白质、核酸、代谢产物为检测对象,对副溶血弧菌的快速检测方法作一综述。

1 以菌体为检测对象的检测技术

1.1 传统培养法

食品安全国家标准(GB4789.7-2013)《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》,规定传统培养法为副溶血弧菌的检测方法。该方法包括增菌培养、选择培养、生化实验、血清学反应等过程,整个过程需要4～5 d,耗时长、操作繁琐,已经不太适合现在实际检验工作的需要。目前商品化的副溶血弧菌显色培养基(TCBS、TSI、CHROMagar等)依靠酶与底物的显色反应,减少了纯培养和生化鉴定的步骤,大大提高了检测效率。在此基础上,进一步发展出了VP快速检测片和弧菌快速检测试剂盒,对纯菌的检测灵敏度达到8 cfu/mL,且只需24 h即可完成检验工作[2]。显色培养基和VP快速测试片敏感度高、特异性强、重复性好、操作简单,可用于食品和水产品中副溶血弧菌的快速初筛。

1.2 利用噬菌体检测副溶血弧菌

应用噬菌体检测副溶血弧菌需预先筛选性能稳定、裂解力强、裂解谱不同的噬菌体株。通过利用噬菌体的高度专一性特点,从副溶血弧菌分离得到噬菌体,将其与细菌荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系结合可实现对副溶血弧菌的定量检测[3]。该方法检测副溶血弧菌回收率可以达到95%以上,重复实验偏差小于1,可检出浓度为1 cfu/mL的副溶血弧菌,整个检测过程只需4.5 h。该方法准确度、复性、精密度都达到较高的要求,且用时短,适用于现代快速检测[4]。但副溶血弧菌噬菌体裂解谱较窄,使其应用受到极大的限制,可以通过改造噬菌体基因组或混合不同裂解谱的噬菌体来进行优化。

1.2 红外光谱检测技术

加热处理后,副溶血弧菌中的核酸、结构蛋白、多糖、脂质均发生了变化,其细胞膜、细胞壁均遭受损伤。显微红外光谱技术结合化学计量学分析,除了可将正常细菌与受损细菌很明显的区分开来,也可将损伤程度不同的细菌基本区分开来[5]。因此显微红外光谱技术具有检测热激后亚致死损伤的副溶血弧菌的潜力,该技术可以用于加工后的水产品中副溶血弧菌的检测。但是由于此法需要配备特殊的仪器,且对操作人员技术水平有一定要求,所以此项技术目前无法在基层单位推广。

2 以核酸为检测对象的检测技术

2.1 PCR法

副溶血弧菌的致病性主要是由于其产生的TDH、TRH毒素,所以早期的副溶血弧菌的PCR法主要是检测编码TDH、TRH毒力蛋白的致病基因tdh、trh[6]。但是,这两种基因的携带率很低,随后被tlh基因取代。除此之外,toxRS、gyrB、tl、Hua-a、GS-PCR、fla、pR72H、collagenase等也可以作为PCR检测副溶的靶基因[7-9]。PCR技术操作简便,用时短,但是在操作过程中容易被DNA污染,且在灵敏度、多基因检测等方面有一定的局限性,不适合于用于副溶血弧菌的大规模筛选和培养检测。近年来传统PCR基础上发展了许多PCR改良技术,如多重PCR、实时荧光定量PCR、MPN-PCR[10]以及PCR与其他技术的融合技术[11]等,从不同方面弥补了传统PCR的不足。

与常规PCR相比,多重PCR(M PCR)方法不仅节省时间和材料,还可以减少和避免因步骤过多而污染带来的假阳性问题。以副溶血性弧菌tdh基因和弧菌属的tl基因为靶基因设计两对引物来检测新鲜海水贝类样品中副溶血性弧菌,最低检出限可达到2.5×102cfu/mL[9]。多重PCR与单一PCR(其检测限一般为102～103cfu/mL)相比,不仅提高了检测灵敏度,还可以同时检测多种菌,大大缩短了检测时间。例如,可以通过设计两对特殊引物atpA-VP-F、atpA-VP-R同时将副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、霍乱弧菌(V.cholerae)、创伤弧菌(V.vulnificus)从其他弧菌和中分离出来[12]。但是,由于含有多对引物,在实验中引物之间,引物和模板之间易出现非特异性结合等假阳性现象,故在设计引物时,要充分考虑到非特异性结合,选择的目的片段要有较高的特异性和明显的长度差别。

实时荧光定量PCR(RT-PCR)是在反应体系中加入荧光基团,通过检测荧光量来实现定量检测。多重实时荧光定量PCR可以同时检测副溶血弧菌的多个基因以及基因的实时表达水平,同时它也能检测多种菌,且扩增结束不需要电泳确认,大大提高了检测效率[13-15]。用副溶血性弧菌的H-NS基因的保守区域设计引物,采用实时荧光定量PCR技术检测样品,检测灵敏度为7.3×10 cfu/mL[16]。实时荧光定量PCR法用时短、特异性好、灵敏度高、重复性好。但是,由于其探针成本高、设计难,目前多能用于实验室操作和进出口食品的检测中,未来该技术的发展主要集中在探针技术的进一步优化上。

以副溶血弧菌特异性的标记基因VP1331为靶基因设计引物,建立的副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,能成功将副溶血弧菌从其他弧菌和非弧菌中检测出来[17]。使用巢式PCR的优点在于,如果第一次扩增产生了错误片断,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。此方法方便、快捷、特异性强,但是第二次扩增时容易引起交叉污染,可以通过利用内外引物的Tm值不同在同一反应管中操作来克服这一缺点。

表1 PCR法检测副溶血弧菌的靶基因汇总表

2.2 环介导等温扩增技术(LAMP)

环介导等温扩增技术是在PCR的基础上发展起来的。LAMP在恒定温度(60～65 ℃)下,DNA模板和引物通过链置换型DNA聚合酶作用,合成长短不一的哑铃状DNA片段,整个过程只需15～30 min,靶基因即能达到109～1010倍的扩增,具有特异性强、灵敏度高(一般为101～102cfu/mL)、操作简单和结果凭肉眼可见等特点,目前已被广泛用于各种致病菌的检测。多种LAMP快速检测试剂盒已被成功开发[24-28]。以副溶血弧菌tlh基因为靶基因设计引物,在反应体系中加入反应指示剂HNB,建立的LAMP-HNB法,其灵敏度是PCR的10～100倍[29]。除此之外,还可以将LAMP法与FITE核酸检测侧向层析试纸结合(LAMP-LFD)来进行检测[30]。LAMP技术不需要特殊的仪器,适用于现场快速检测副溶。但LAMP引物设计较难,扩增得到的DNA只能用于观察,不能作其他用途。

2.3 基因芯片

基因芯片可同时高通量检测多株副溶血弧菌的多个基因及基因的表达、SNP突变和缺失,具有较好的特异性和检测灵敏度。目前,已有商品化的副溶血弧菌基因组芯片出售。Wang等[22]利用多重PCR同时扩增目标基因(tlh、tdh和fla)作为副溶血性弧菌分子标记,将与生物素标记的PCR产物进行杂交的引物固定在芯片上,通过化学发光法检测碱性磷酸酶标记亲和素,成功将副溶血弧菌毒株、副溶血弧菌无毒菌株、其他弧菌从混合菌中检测出。检测时间只需2～3 h,检测灵敏度达到2 pg/反应体系。除此之外,还可以建立基因库,同时检测副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、霍乱弧菌(V.cholerae)、创伤弧菌(V.vulnificus)、拟态弧菌(V.mimicus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)和哈维氏弧菌(V.harveyi)七大水产品食源性致病菌[31]。基因芯片技术成本过高、制作难,目前已逐渐被转录组测序等技术取代。

2.4 变性高效液相色谱检测技术(DHPLC)

变性高效液相色谱可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。2010年廖亮等[32]利用PCR-DHPLC技术建立副溶血弧菌特异性基因检测平台,当PCR产物出现特异性的样品洗脱峰时,即可进行结果判断。不仅有效避免了PCR产物电泳检测的后污染,并使检测成本明显降低,具有简便快捷、高通量和自动化的特点,且其准确性和灵敏度高,重复性好,是一种较好的食源性病原菌检测及其流行病学监测手段。2015年Zhan等[33]在此基础上,建立了一种多重聚合酶链反应-变性高效液相色谱法(MPCR-DHPLC),该技术可以同时检测霍乱弧菌(V.cholerae)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、拟态弧菌(V.mimicus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)六种水产品中常见菌,从采样到完成整个实验仅需5～6 h,检测结果与传统培养法一致。MPCR-DHPLC具有特异性强、灵敏度大、准确度高,操作便捷等特点,在副溶血弧菌快速检测中具有重要应用价值。

3 以蛋白质为检测对象的检测技术

3.1 酶联免疫吸附技术(ELISA)

ELISA是在免疫酶技术(Immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种免疫检测技术,包括直接法[34]、间接法[35]、双抗夹心法[36]等。窦勇等[36]于2015年建立了副溶血弧菌TDH毒素双抗体夹心ELISA检测法(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA),以TDH+副溶血弧菌菌体及其TDH毒素制备免疫原,分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,制备兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体和鼠抗TDH毒素多克隆抗体,以鼠抗TDH毒素多克隆抗体为捕获抗体,兔抗副溶血弧菌多克隆抗体为检测抗体,建立DAS-ELISA检测法。结果检测总时间为5 h,该法具有很强的特异性,对食品中TDH毒素的检测低限为60 μg/g。但是ELISA对试剂的选择性要求过高、对结构类似的化合物存在一定程度的交叉反应,且当副溶血弧菌含量较低时无法分析。Di Pinto等[37]于2012年建立了PCR-ELISA,其灵敏度相比传统方法提高了100倍,既可增加检测的灵敏度又可降低交叉反应,具有很好的应用前景。

3.2 免疫胶体金技术(ICG)

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物基于抗原抗体反应的一种免疫标记技术,具有简便、快速的优点,已广泛应用于临床、食品检测、环境污染、生物沾染和生物制剂的快速检测[38]。现阶段,免疫胶体金技术的发展主要集中在试剂盒和试纸条上。斑点免疫胶体金渗滤测试盒能够特异性检测副溶血弧菌TDH,最低检测限达到250 ng/mL TDH,为副溶血弧菌的现场检测提供了便利[39]。相比于试剂盒,试纸条技术更适合于人们日常生活的使用。免疫金层析试纸条法(IGCA),仅需5～15 min即可判断结果,其对副溶血弧菌的最低检测量为3.592×104cfu/mL且价格低廉,能很好的满足基层的需要[40]。但是,由于免疫金层析试纸条技术的灵敏度低、抗原选择难、假阳性率高,目前该技术还无法广泛运用,现阶段对该技术的研究主要集中在抗原的选择上。

3.3 上转换发光免疫层析(UPT-LF)

上转换发光免疫层析(UPT-LF)技术,具有较高的耐受度,不受操作环境、人为、设备因素的限制,操作简捷,能定量检测等诸多优点[41]。目前有研究者研制出了针对甲型副伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphiA)、乙型副伤寒沙门菌(S.paratyphiB)、大肠埃希菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)四种菌的UPT-LF试纸,以4种靶标菌的系列浓度标准菌悬液作为标准样品,评价试纸的敏感性、特异性、线性和精密,结果显示,UPT-LF技术具有良好的敏感性、特异性和线性定量能力[42]。但是由于上转换发光效率、激光器件结构、稀土离子的掺杂方案和基质材料还存在问题,导致检测结果不太稳定,所以该技术仍需进一步改进。

3.4 生物传感器技术

生物传感器是一种生物信号转换为电信号的分析装置,可用于检测菌体、酶、抗体、核酸等[43]。一种基于分子马达技术生物传感器技术,以副溶血性弧菌毒力基因tdh、trh和种特异性基因tlh、toxR为靶基因设计4个探针,通过生物素-亲和素系统将探针与分子马达连接构建F0F1-ATPase分子马达生物传感器,实现对携带和非携带毒力基因的副溶血性弧菌进行快速分类[44]。Zhao等[45]用HPR标记副溶血弧菌抗体掺于琼脂糖和纳米金中并修饰于丝网印刷电极的表面,制备一次性电化学免疫传感器来快速检测副溶血弧菌。其免疫电极的线性检测范围为105～106cfu/mL,检出限为7.4×104cfu/mL(S/N=3)。为了进一步提高其灵敏度,最近一种新的比色传感器技术被成功设计出来,该方法将纳米金粒子(AuNPs)作为辣根过氧化物酶(HRP)和适配体的载体,当目标存在时,可形成纳米金粒子-辣根过氧化物酶-适配体-目标-适配体-磁性纳米粒子(AuNPs-HRP-aptamer-target-aptamer-MNPs)的“三明治”结构(如图1),使检测限降低至10 cfu/mL[46]。

表2 副溶血弧菌快速检测技术汇总表

随后,一种超灵敏无标记的多功能化氧化石墨烯电化学发光免疫传感器也被成功设计出来,该技术将N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)和VP抗体(抗VP)同时固定在磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)表面来制备多功能化氧化石墨烯(如图2),ABEI和VP抗体分别作为电化学发光基团和VP捕获装置,从而对海水和海鲜中副溶血弧菌进行检测,其在海水和海产品中的副溶血弧菌的检测限分别为5 cfu/mL和5 cfu/g[47]。该技术快、准,有很大发展潜力,在食品安全相关的各种生物分子的简单的监控中具有很大的发展潜力。

图1 应用辣根过氧化物酶比色传感器技术检测副溶血弧菌示意图[46]Fig.1 Schematic presentation of V. parahaemolyticus detection using a colorimetric aptasensor based on horseradish peroxidase[46]

图2 多功能化氧化石墨烯电化学发光免疫传感器原理图[47]Fig.2 The schematic diagram for the preparation of multi-functionalized graphene oxide and the electrochemiluminescence immunosensor[47]

4 以代谢产物为检测对象的检测技术

微生物在生长代谢过程中可产生特有的挥发性代谢产物,具有微生物种的特异性。电子鼻技术是检测挥发性成分的人工嗅觉装置,可以通过检测微生物特异的挥发性代谢产物实现对微生物的检测。通过SPME-GC-MS联用,选择合适的萃取头,可检测副溶血弧菌经纯培养后产生的挥发性代谢产物(2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶、二叔丁基过氧化氢、3-甲基-1-丁醇等),结果表明,副溶血弧菌经纯培养后产生了明显不同于空白培养液、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的挥发性代谢产物[48]。电子舌技术先以样品培养物建立副溶血弧菌簇类独立软模式的判别模型,并用此模型对其他致病性弧菌进行判别,得到SIMCA识别方法能够有效的判别副溶血弧菌和其他致病性弧菌,为副溶血弧菌快速检测开辟了新的道路[49]。但是电子舌与电子鼻技术价格昂贵,且灵敏度差、特异性差,故该技术仍需进一步改进。

5 前景与展望

本文对副溶血弧菌的快速检测方法的研究进展做了一个较全面的介绍,各种技术都有其优势和不足。传统的副溶血弧菌国标检测方法操作复杂,相当耗时;现阶段进出口食品中副溶血弧菌的快速检测一般是将LAMP、实时荧光PCR等技术与传统技术结合使用;此外,传感器技术、显色培养基、VP快速鉴定试剂盒等技术,因其局限性现阶段多应用于实验室;免疫金层析试纸条因其价格便宜、快速、操作简单、结果直观而广泛用于基层养殖与日常生活中。

现阶段对副溶血弧菌的快速检测技术的研究有四大发展趋势:一是开发新的技术,例如一种基于低噪声激发式荧光标记的副溶血弧菌免疫层析检测试纸条的开发[50];二是在已有技术的基础上进行技术优化和融合,比如适配体技术和胶体金相结合可开发实用、快速的现场检测技术;三是同步检测出副溶血弧菌并辨识是否为携带tdh或trh的致病性菌株;四是通过技术改良同时检测出多种海洋弧菌,既节省时间,又可以简化工序。随着检测技术的不断优化发展,副溶血弧菌检测技术必将得到巨大改进与提高,朝着更快速、更简便、更经济、更安全、更准确的方向发展。

[1]Bisha B,Simonson J,Janes M,et al. A review of the current status of cultural and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus[J]. International Journal of Food Science & Technology,2012,47(5):885-899.

[2]许如苏,林彩华,黄桂荣,等. 副溶血性弧菌快速测试片检测性能研究[J]. 中国卫生检验杂志,2009,18(12):2621-2622.

[3]Peng Y,Jin Y,Lin H,et al. Application of the VPp1 bacteriophage combined with a coupled enzyme system in the rapid detection ofVibrioparahaemolyticus[J]. Journal of Microbiological Methods,2014,98:99-104.

[4]纪懿芳,胡文忠,姜爱丽,等. 海产品中副溶血弧菌检测方法研究进展[J]. 食品工业科技,2015,36(5):365-369.

[5]喻文娟,施春雷,刘玉敏,等. 副溶血弧菌的热激亚致死损伤与显微红外光谱检测[J]. 分析化学,2013(10):1470-1476.

[6]Tada J,Ohashi T,Nishimura N,et al. Detection of the thermostable direct hemolysin gene(tdh)and the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene(trh)ofVibrioparahaemolyticusby polymerase chain reaction[J]. Molecular and Cellular probes,1992,6(6):477-487.

[7]慕艳娟,许崛琼,潘子豪,等. 以toxR-S为靶基因的副溶血弧菌PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学,2015(10):991-999.

[8]Venkateswaran K,Dohmoto N,Harayama S. Cloning and Nucleotide Sequence of the gyrB Gene ofVibrioparahaemolyticusand Its Application in Detection of This Pathogen in Shrimp[J]. Applied and Environmental Microbiology,1998,64(2):681-687.

[9]强世龙,张公亮,孙黎明,等. 双重PCR快速检测海水贝类中副溶血性弧菌[J]. 大连工业大学学报,2015,34(1):6-10.

[10]Shima T,Isobe J,Kimata K,et al. Evaluation of a Rapid Test for Determination of Most Probable Number of ViableVibrioparahaemolyticusby Using Etidium Monoazide[J]. Japanese Journal of Food Microbiology,2011,28(1):21-28.

[11]Malcolm TTH,Cheah YK,Radzi CWJWM,et al. Detection and quantification of pathogenicVibrioparahaemolyticusin shellfish by using multiplex PCR and loop-mediated isothermal amplification assay[J]. Food Control,2015,47:664-671.

[12]Izumiya H,Matsumoto K,Yahiro S,et al. Multiplex PCR assay for identification of three major pathogenic Vibrio spp.,Vibrio cholerae,Vibrioparahaemolyticus,andVibriovulnificus[J]. Molecular and Cellular Probes,2011,25(4):174-176.

[13]Garrido A,Chapela M-J,Ferreira M,et al. Development of a multiplex real-time PCR method for pathogenicVibrioparahaemolyticusdetection(tdh+ and trh+)[J]. Food Control,2012,24(1):128-135.

[14]Robert-Pillot A,Copin S,Gay M,et al. Total and pathogenicVibrioparahaemolyticusin shrimp:Fast and reliable quantification by real-time PCR[J]. International Journal of Food Microbiology,2010,143(3):190-197.

[15]林雪,陈泽辉,翁琴云,等. 应用多重实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌及其毒力基因[J]. 中国卫生检验杂志,2015(6):870-872.

[16]朱耀磊,桑雪,甘未祺,等. H-NS基因作为靶基因的荧光定量PCR快速检测海产品中的副溶血性弧菌[J]. 食品工业科技,2015(19):155-158,162.

[17]张德福,樊晓琳,付绪磊,等. 巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌[J]. 现代食品科技,2015(11):1-8.

[18]Blanco-Abad V,Ansede-Bermejo J,Rodriguez-Castro A,et al. Evaluation of different procedures for the optimized detection ofVibrioparahaemolyticusin mussels and environmental samples[J]. International Journal of Food Microbiology,2009,129(3):229-236.

[19]Nordstrom JL,Vickery MC,Blackstone GM,et al. Development of a multiplex real-time PCR assay with an internal amplification control for the detection of total and pathogenicVibrioparahaemolyticusbacteria in oysters[J]. Applied and Environmental Microbiology,2007,73(18):5840-5847.

[20]Bej AK,Patterson DP,Brasher CW,et al. Detection of total and hemolysin-producingVibrioparahaemolyticusin shellfish using multiplex PCR amplification of tl,tdh and trh[J]. Journal of Microbiological Methods,1999,36(3):215-225.

[21]Matsumoto C,Okuda J,Ishibashi M,et al. Pandemic spread of an O3:K6 clone ofVibrioparahaemolyticusand emergence of related strains evidenced by arbitrarily primed PCR and toxRS sequence analyses[J]. Journal of Clinical Microbiology,2000,38(2):578-585.

[22]Wang R,Huang J,Zhang W,et al. Detection and identification ofVibrioparahaemolyticusby multiplex PCR and DNA-DNA hybridization on a microarray[J]. Journal of Genetics and Genomics,2011,38(3):129-135.

[23]Lee C-Y,Pan S-F,Chen C-H. Sequence of a cloned pR72H fragment and its use for detection ofVibrioparahaemolyticusin shellfish with the PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology,1995,61(4):1311-1317.

[24]Letchumanan V,Chan K-G,Lee L-H.Vibrioparahaemolyticus:a review on the pathogenesis,prevalence,and advance molecular identification techniques[J]. Front Microbiol,2014,5(705):1-13.

[25]姜侃,张慧,汪新,等. 多重 LAMP—熔解曲线法检测食品中两种食源性致病菌[J]. 食品与机械,2015(2):87-92.

[26]罗茗月,熊礼宽. 恒温扩增技术在病原体检测中的应用[J]. 国际检验医学杂志,2015,36(7):972-976.

[27]黄枝妙,翁育伟. 环介导等温扩增技术及其在病原生物检测中的应用[J]. 中国人兽共患病学报,2015,31(11):1075-1080.

[28]戴婷婷,陆辰晨,郑小波. 环介导等温扩增技术在病原物检测上的应用研究进展[J].南京农业大学学报,2015,38(5):695-703.

[29]纪懿芳,胡文忠,姜爱丽,等. 海产品中副溶血弧菌的LAMP-HNB快速检测技术[J]. 食品与发酵工业,2015,41(7):142-148.

[30]Prompamorn P,Sithigorngul P,Rukpratanporn S,et al. The development of loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick for detection ofVibrioparahaemolyticus[J]. Letters in Applied Microbiology,2011,52(4):344-351.

[31]Chen W,Yu S,Zhang C,et al. Development of a single base extension-tag microarray for the detection of pathogenic Vibrio species in seafood[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2011,89(6):1979-1990.

[32]廖亮,刘宏生. 海产品中副溶血弧菌变性高效液相色谱检测技术研究[J]. 中国卫生工程学,2010(3):220-222.

[33]Zhan X,Zheng Q,Fu J,et al. A Rapid Multiplex PCR-DHPLC Method of Detection and Identification of Pathogenic Bacteria in Aquatic Products[J]. Journal of Food Safety,2015,35(1):50-58.

[34]Honda T,Yoh M,Kongmuang U,et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for detection of thermostable direct hemolysin ofVibrioparahaemolyticus[J]. Journal of Clinical Microbiology,1985,22(3):383-386.

[35]闫茂仓,胡伟丽,张赛乐,等. 基于卵黄抗体的副溶血弧菌间接 ELISA 快速检测方法的建立[J]. 山东畜牧兽医,2015(3):1-2.

[36]窦勇,胡佩红,顾鹏程. DAS-ELISA 法快速检测食品中副溶血弧菌TDH毒素[J]. 基因组学与应用生物学,2015,34(10):2169-2175.

[37]Di Pinto A,Terio V,Di Pinto P,et al. Detection ofVibrioparahaemolyticusin shellfish using polymerase chain reaction-enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Letters in Applied Microbiology,2012,54(6):494-498.

[38]周丽岩,吕宝新,任勃儒,等. 胶体金免疫层析技术在食品安全检测中的应用研究[J]. 中国调味品,2015,40(2):128-131.

[39]杨靖亚,陆晓帆,王珍. 检测副溶血弧菌TDH斑点免疫胶体金渗滤法的研究[J]. 中国免疫学杂志,2012,28(8):733-736.

[40]孔繁德,刘阳,徐淑菲,等. 免疫金层析技术快速检测副溶血弧菌方法的初步研究[J]. 中国兽医科学,2012(8):819-824.

[41]林长青. 上转发光技术及其在食品中病原微生物检测的应用[J]. 食品安全导刊,2015(10):38-41.

[42]李春凤,赵勇,王晓英,等. 基于上转发光免疫层析技术的常见食源性致病菌快速检测方法研究与评价[J]. 军事医学,2015(2):128-132.

[43]Velusamy V,Arshak K,Korostynska O,et al. An overview of foodborne pathogen detection:In the perspective of biosensors[J]. Biotechnology Advances,2010,28(2):232-254.

[44]张捷,李兆杰,王煜,等. 基于分子马达生物传感器技术的副溶血性弧菌分子分型方法的初步研究[J]. 微生物学通报,2013,40(7):1279-1289.

[45]Zhao G,Xing F,Deng S. A disposable amperometric enzyme immunosensor for rapid detection ofVibrioparahaemolyticusin food based on agarose/Nano-Au membrane and screen-printed electrode[J]. Electrochemistry Communications. 2007,9(6):1263-1268.

[46]Wu S,Wang Y,Duan N,et al. Colorimetric Aptasensor Based on Enzyme for the Detection ofVibrioparahemolyticus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63(35):7849-7854.

[47]Sha Y,Zhang X,Li W,et al. A label-free multi-functionalized graphene oxide based electrochemiluminscence immunosensor for ultrasensitive and rapid detection ofVibrioparahaemolyticusin seawater and seafood[J]. Talanta,2016,147:220-225.

[48]操庆国,郭钦,刘涵,等. 三种食源性致病菌挥发性代谢产物谱快速检测研究[J]. 食品工业科技,2014,35(23):290-297.

[49]黄建锋,赵广英,窦文超. 智舌快速检测副溶血弧菌簇类独立软模式识别的建立[J]. 微生物学报,2011(4):538-546.

[50]张捷,杨向莹,许美玲,等.基于低噪声激发式荧光标记的副溶血弧菌免疫层析试纸条:中国,CN104483480A[P]. 2015-04-01.

Advancement of rapid detection technology forVibrioparahaemolyticus

GUO Qin,CHEN Hui,XU Hai-tang,YAN Dong,HE Yu-xuan,HOU Zhao-zhi

(College Food Science and Biotechnology Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Vibrioparahaemolyticusis one of the most important foodborne pathogens,which is widely distributed in coastal waters,submarine sediment and marine life including fish,crustaceans and molluscsis. In the coastal areas of China,the food poisoning caused byV.parahaemolyticushave become primary microbial poisoning reasons. In this paper,many popular rapid detection technologies ofV.parahaemolyticus,such as various PCR methods,ELISA and Biosensor techniques,were introduced based on cells,nucleic acid,protein and metabolites ofV.parahaemolyticusas detection objects. These techniques were compared and the prospective development trends were prospected.

Vibrioparahaemolyticus;foodborne pathogens;rapid detection methods

2016-05-27

郭钦(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：食源性致病菌和食品安全，E-mail：guoqin_shiyin@163.com

国家自然科学基金资助项目(31201373)；江苏大学人才启动基金(1281360012)；江苏大学大学生实践创新项目(13A111)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000