人工重组促红细胞生成素预防大鼠股骨头坏死的形态学研究

蒋鲁勇，余霄，颜勇卿，庞清江

人工重组促红细胞生成素预防大鼠股骨头坏死的形态学研究

蒋鲁勇，余霄，颜勇卿，庞清江

目的通过骨的形态学变化来探讨人工重组促红细胞生成素（rHuEPO）对大鼠股骨头缺血坏死（ONFH）的预防作用。方法将36只Wristar大鼠随机分为3组。激素组：每周3次在大鼠后腿肌注地塞米松1mg/kg，连续用药4周；对照组：每周3次在大鼠后腿肌注等量0.9％氯化钠注射液，连续用药4周；促红素组：每周3次在大鼠后腿肌注地塞米松1mg/kg，连续用药4周；并且每天腹腔内注射rHuEPO500U·kg―1·d―1，连续用药4周。制模后取股骨头标本，切片并HE染色，用光学显微镜观察股骨头形态学变化。结果HE染色发现激素组较对照组骨小梁明显稀疏、变窄，形态不规则，骨小梁分割程度下降，部分可见骨细胞胞核皱缩、溶解、消失。而促红素组较激素组病变明显减轻，骨小梁形态较为规则，小梁连接程度明显优于激素组，部分骨小梁较粗，断裂明显减少，骨小梁分割程度较高。结论rHuEPO可以有效地减缓激素性ONFH过程中骨形态学的变化，预防骨组织结构破坏，从而起到延缓或预防ONFH的作用。

股骨头坏死；人工重组促红细胞生成素

股骨头缺血坏死（ONFH）是由多种原因引起股骨头血供破坏而导致软骨下骨变性坏死，从而造成股骨头塌陷，若不及时干预，70％的患者将发生股骨头塌陷，最终需行髋关节置换［1］。近年来，国内外学者对ONFH的病因和发病机制进行了深入研究，主要有血管内凝血学说、脂类代谢紊乱学说、二次碰撞学说及骨内压增高学说等［2-3］，但确切病生理学机制现仍不完全明了。

促红细胞生成素（EPO）是第一个被发现并具备临床应用价值的造血生长因子。当初只认识到其是由肾小管旁细胞分泌，功能是刺激红细胞的生长，并由此而得名。目前发现除了主要产生于肾脏外，它还产生于肝脏、神经组织、女性生殖系统、胎盘和睾丸等组织，并广泛存在于人体的各个系统内。利用基因重组技术能够人工合成重组人促红细胞生成素（rHuEPO），其分子量较天然EPO小，理化性质和生物学活性与天然EPO无差异。大量研究表明，EPO不但能够有效促进红细胞生成，同时还有保护细胞的作用，特别是能够阻止内皮细胞、神经细胞和心肌细胞凋亡，并有促进血管生成的作用［4］。本研究旨在通过动物实验探讨rHuEPO对激素冲击大鼠缺血性股骨头坏死的预防作用，报道如下。

1　资料与方法

1.1大鼠ONFH模型的建立取健康成年Wristar大鼠36只，雌雄各半，每只体质量约为250 g。所有大鼠均在同一环境和条件下饲养，采用普通颗粒饲料进行饲养，采取自然光照，温度控制在（20±2）℃，湿度50％左右。饲养1周后逐个称重，将36只Wristar大鼠采用随机数字表法随机分为3组：激素组、对照组和促红素组，各12只，雌雄各半。所有在试验中的动物及操作均符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

3组动物模型的具体建立方法如下：（1）激素组：每周3次在大鼠后腿肌注地塞米松1 mg/kg，连续用药4周；（2）对照组：每周3次在大鼠后腿肌注等量0.9％氯化钠注射液，连续用药4周；（3）促红素组：每周3次在大鼠后腿肌注地塞米松1 mg/kg，连续用药4周；并且每天腹腔内注射rHuEPO 500 U·kg―1·d―1，连续用药4周。

1.2动物观察每天观察实验动物的生命状态、体质量、排泄情况及有无体表感染等，每只动物准确称体质量。为增加动物的活动量，实行每天定时自由活动2 h。

1.3HE染色4周后3组动物均麻醉后处死，切取双侧股骨头标本用于HE染色。取材时观察股骨头表面是否光滑完整，形态是否正常。将所取标本用体积分数10％中性甲醛溶液（0.1 mol/L，pH=7.4）4℃固定4 d，然后PBS溶液冲洗，放在缓冲液大约体积分数10％ EDTA-Tris里面，37.4℃脱钙，仔细注意骨表面的颜色，并且采用物理法准确测量脱钙程度。完全脱钙后进行取材，乙醇逐级脱水，二甲苯透明处理2 h，用石蜡进行包埋，切片后行HE染色。在光学显微镜下观察骨组织、骨髓组织及骨小梁结构变化。

2　结果

2.1动物的一般情况3组大鼠状态良好。用药4周后激素组和促红素组大鼠大部分后肢和背部毛发脱落、稀疏；对照组大鼠毛发无明显改变。整个实验期间，无动物死亡，激素组有部分动物活动减少，食欲可；其余两组未见明显异常。

2.2HE染色结果的观察对照组（封四彩图1）：骨小梁呈圆形或椭圆形拱形结构，结构完整，骨小梁连接性高，无破骨细胞和骨小梁变窄、断裂等情况出现。激素组（封四彩图2）：雄性中5只大鼠可见骨小梁明显稀疏、变窄，甚至断裂，连接率降低，部分拱形结构消失，形态不规则，骨小梁分割程度下降并伴有较多破骨细胞出现；雌性中有4只大鼠可见上述病变。其他大鼠均有不同程度的骨小梁变窄、连接率降低等情况发生。促红素组（封四彩图3）：较激素组，雄性和雌性病变明显减轻，骨小梁形态较为规则，小梁连接程度明显优于激素组，部分骨小梁变粗，断裂明显减少，缺损处出现连接和修复，部分结构接近对照组，骨小梁分割程度较高且可见较多成骨细胞。

3　讨论

激素是引起ONFH最常见的病因之一，研究表明大剂量使用激素是导致ONFH的一个独立性危险因素。Inue等［5］报道了287例肾移植患者口服强的松龙≥25.0 mg/d，其中18例明确发生ONFH，发生率为6.3％。在使用激素治疗严重急性呼吸窘迫综合征的患者中也发现，使用强的松龙等效累积剂量不足3 g的患者发生ONFH的风险是0.6％；而超过3 g者风险提高到13％［6］。激素的长期大剂量应用可导致基因突变，从而使血液处于高凝低纤溶状态。高凝低纤溶会介导股骨头静脉内血栓的形成，致使静脉压增高、血流淤滞、引起动脉血流受损，进一步造成骨细胞的缺血、缺氧及坏死，破坏骨组织结构和功能，最终引起ONFH。虽然激素导致ONFH的机制目前尚无明确定论，但其增加ONFH风险的这一事实已被广大学者所认可。

EPO是一种单链酸性糖蛋白，能够促进网织红细胞和内皮细胞的增殖分化，刺激血管生成以及细胞再生，具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、减轻心肾组织损伤和改善局部微循环等作用。随着对EPO及其受体研究的日益深入，EPO已经越来越多的被临床所应用。如利用其促进红细胞生成的功能，治疗多种贫血和肿瘤；利用EPO的抗炎、抗细胞凋亡等多种功能，治疗骨骼肌与心肌的缺血再灌注损伤；利用其对急性心肌梗死和心力衰竭的保护作用而应用于心血管疾病的临床治疗。最新的研究还发现，在骨骼肌损伤后，EPO具有促进损伤骨骼肌恢复的功能。它通过促使骨骼肌细胞更快更好地恢复和促进微循环的建立，从而在骨骼肌损伤后的修复过程中发挥了极其重要的作用［7］。此外，EPO及其受体EPO-R还广泛表达于中枢与外周的神经系统，并在神经损伤后的修复中发挥着重要作用［8］。由于EPO具有促血管生成、抑制细胞凋亡以及促进损伤的骨骼肌和外周神经修复的多种功能，有理由推断，EPO在骨重建的过程中也必将发挥着十分重要的作用。本实验就是根据股骨头坏死的发病机制和EPO改善微循环、抗细胞凋亡等作用来探讨rHuEPO对股骨头坏死的预防作用。

本研究结果显示，根据激素组的HE染色结果，12只大鼠中9只大鼠骨小梁明显稀疏、变窄甚至断裂，连接率降低，形态不规则，空骨陷窝增多，部分拱形结构消失，骨小梁分割程度明显下降并伴有破骨细胞出现，部分可见骨细胞胞核皱缩、溶解及消失；剩余3只亦有不同程度的骨小梁变窄和连接率降低。说明激素的使用严重影响到大鼠股骨头骨小梁的数量及质量，骨组织受到破坏，引起股骨头坏死，提示本次实验造模成功。促红素组动物组织病理学显示：较激素组病变明显减轻，骨小梁形态较为规则，小梁连接程度明显优于激素组，缺损处出现连接和修复，可见较多成骨细胞。这说明rHuEPO可以通过改善微循环、抗细胞凋亡等作用减少骨细胞凋亡，阻止股骨头塌陷，进而起到预防股骨头坏死发生的作用。

综上所述，rHuEPO同时具备促血管生成的作用和抑制细胞凋亡的作用，能够保持股骨头形态，对于ONFH预防的短期效果明显，但是长期效果还需进一步进行研究，而且其预防作用的机制还需进一步深入探讨。

［1］赵海燕，夏亚一，康鹏德，等.股骨头坏死病因与发病机制研究进展［J］.中国矫形外科杂志，2009，17（8）：604-607.

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［3］史跃，尹文洲，陈启忠，等.自体骨髓间充质干细胞动脉灌注联合局部注射治疗股骨头坏死［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（6）：1065-1069.

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［5］Inue S，Horii M，Asano T，et al.Risk faetors for nontraumatic osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation ［J］.J Orthop Sci，2003，8（6）：751-756.

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.059

R681.8

A

1671-0800（2016）08-1089-03

2016-05-12

（本文编辑：钟美春）

浙江省自然科学基金资助项目（LY12H06002）；宁波市自然科学基金资助项目（2013A610255）

315030宁波，宁波市第二医院

庞清江，Email：pqjey@sina.com