磷酸二酯酶5基因在肾癌组织中表达情况的研究

潘晓波，王雪，任雨，翁国斌

磷酸二酯酶5基因在肾癌组织中表达情况的研究

潘晓波，王雪，任雨，翁国斌

目的探讨磷酸二酯酶5（PDE5）基因在肾癌组织中的表达情况。方法采用RT-qPCR和Westernblot实验检测45例肾癌及其癌旁组织中PDE5基因的表达水平。结果肾癌PDE5/癌旁PDE5的mRNA阳性表达相对Ct值为（1.65±0.1189），差异有统计学意义（＜0.01）；肾癌PDE5/癌旁PDE5的蛋白阳性表达的相对灰度值为（2.664±0.3419），差异有统计学意义（＜0.01）。结论PDE5基因在肾癌的发生发展中可能起重要作用。

磷酸二酯酶5；肾肿瘤；癌

肾癌是泌尿系统较常见的恶性肿瘤之一，目前手术切除仍是主要的治疗手段。近些年分析肾癌的生物学特性，探索其治疗的新途径成为了临床关注的热点。有研究发现磷酸二酯酶5（PDE5）在某些肿瘤如结肠癌、膀胱癌及乳腺癌等肿瘤中呈强阳性表达且活性明显增加进而调控肿瘤细胞凋亡，由此推测PDE5在肿瘤的发生发展中起到重要作用。然而，PDE5在肾癌中的表达情况还不清楚，因此，本研究采用RT-qPCR、Western blot实验研究PDE5基因在肾癌组织中的表达情况，为今后肾癌的临床治疗寻找新靶点提供理论依据。报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料收集宁波大学医学院附属鄞州医院2011—2015年手术切除的肾癌组织45例，术前均未行放化疗，标本均于术后立即取材并保存在液氮中。选取距肿瘤边缘2 cm以上的癌旁组织作对照。其中男27例，女18例；年龄28～82岁，平均（56.99±4.98）岁；按AJCC标准进行病理分期：T1～T2 32例，T3～T4 13例；按TNM分期标准：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期16例；分化程度：高分化9例，中分化31例，低（未）分化5例；肿瘤直径：≥4cm者19例，＜4cm者26例。

1.2检测方法

1.2.1RT-qPCR实验检测PDE5mRNA在不同组织中的表达。分别取肾癌组织及癌旁组织，采用TrizolReagent试剂盒（Invitrogen，美国）提取细胞总RNA，测量RNA浓度，然后应用逆转录试剂盒（Toyobo，日本）进行逆转录合成cDNA。合成后的cDNA进行聚合酶链反应（Toyobo，日本），肌动蛋白（B-actin）作内参对照。根据PDE5及B-actin基因序列设计引物为：PDE-5正向5’-CACACCGAATCTTGCTCTTG-3’，反向5’-TCAGAATCCTTGACAACAATGG-3’，扩增产物134 bp；B-actin正向5’-AATCGTGCGTGACATTAAG-3’，反向5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’，扩增产物178bp。定量的方法参照文献［1］，以Ct法表示基因的表达量。

1.2.2Western blot实验检测PDE5蛋白在不同组织中的表达量。将肾癌组织及癌旁正常组织用组织蛋白提取液匀浆后，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，溶解于冰浴PBS缓冲液（0.lmol/LTris-HCl，pH 8.0、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1％乙基苯基聚乙二醇、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.1％蛋白酶抑制剂混合物、10mmol/LPMSF），30 min。4℃下21 000 r/min离心30min，离心收集上清液，Bradford法检测蛋白浓度，取溶于缓冲液中的20 mg蛋白质行12％SDSPAGE电泳，转PVDF膜上，加入相应抗体进行免疫印记。由ECL试剂盒（碧云天生物技术研究所）完成检测，应用Quantity One 4.4软件处理分析。

1.3统计方法采用SPSS19.0统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差表示，两组比较用检验，计数资料比较用2检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1PDE5 mRNA在肾癌及癌旁组织中的表达情况134 bp（PDE5）及178 bp （B-actin）处均有单一特异性条带，134bp处的条带肾癌组较癌旁组织组明显（封三彩图2A），肾癌组织中的PDE5 mRNA表达明显高于癌旁组织（封三彩图2B），差异有统计学意义（=5.323，＜0.05）。

2.2PDE5蛋白在肾癌及癌旁组织中的表达情况肾癌及癌旁组织组织内均有PDE5蛋白表达，蛋白条带位置为105 kDa（封三彩图3A）。蛋白条带灰度值分析表明，PDE5蛋白在肾癌组织中表达较癌旁组织明显增高（封三彩图3B），差异有统计学意义（=4.869，＜0.05）。

3　讨论

PDE5是环核苷酸水解酶超家族的成员之一，可以特异性水解细胞内第二信使cGMP［2］，最早从大鼠的肺中提纯出来［3］，后在1993年首次被克隆［4］。PDE5主要分布于大脑、阴茎海绵体、血管平滑肌细胞、肺及血小板等［5］，主要是调节平滑肌的收缩，同时在大脑内cGMP信号传递上起到重要的作用［6］。

国内外研究证实，PDE5在结肠癌、膀胱癌及乳腺癌中高表达且活性增加［7-8］，但其在人肾癌组织中的表达情况如何，目前尚未见报道。本研究显示PDE5在肾癌组织中的表达较癌旁组织高（＜0.05），提示其可能在肾癌的发生发展中起重要作用。研究发现PDE5抑制剂对多种肿瘤细胞具有抑制作用，有研究发现PDE5在甲状腺肿瘤中高表达，应用西地那非阻止了肿瘤细胞的生长及转移［9-10］。Kwon等［11］报道，PDE5抑制剂提高了结肠癌细胞内cGMP浓度，激活了下游的PKG，进而抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡。Ren等［12］通过转染表达PDE5特异性的反义序列的载体于人肾癌OSRC2细胞，PDE5基因表达减少，促进了细胞凋亡，研究表明cGMP/PKG信号传导通路在调节肾癌细胞的增殖和存活方面起着重要的作用。由此可见，PDE5抑制剂可以抑制细胞内cGMP的特异性水解，提高肿瘤细胞内浓度，激活下游PKG，使细胞增殖抑制，发挥抗凋亡作用。本研究发现PDE5在肾癌组织中也呈高表达，因此推测cGMP/PKG信号传导通路在肾癌的发生发展中起重要作用，但具体作用机制尚需研究，为进一步研究肾癌的发生发展机制提供理论依据，同时为探索肾癌治疗新途径提供实验基础。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.009

R737.11

A

1671-0800（2016）08-0997-02

2016-01-25

（本文编辑：孙海儿）

315040宁波，宁波大学医学院附属鄞州医院

潘晓波，Email：179571095 @qq.com