非酒精性脂肪性肝病动物模型研究进展

喻 琴综述，王 丽审校

（西南医科大学：1基础医学院；2附属中医医院中西医结合研究中心，四川泸州 646000）

非酒精性脂肪性肝病动物模型研究进展

喻 琴1综述，王 丽2审校

（西南医科大学：1基础医学院；2附属中医医院中西医结合研究中心，四川泸州 646000）

非酒精性脂肪性肝病；脂肪性肝炎；动物模型

非酒精性脂肪性肝病 （nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指由非酒精因素和其他不明病因所致的，以大量脂肪堆积于肝细胞内为主要特征的临床病理综合征，可从单纯性脂肪肝发展至脂肪性肝炎、肝纤维化，甚至导致肝硬化的发生。其病理改变主要有肝细胞脂肪变性、肝细胞气球样变、以淋巴细胞为主的炎细胞浸润和纤维化等[1]。近年来，随着人们生活方式和饮食结构的改变，我国的NAFLD发病率成逐年上升趋势，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，其病因和发病机制复杂，目前仍未完全阐明，其主要环节可能是胰岛素抵抗（IR）和氧化应激，此外，脂联素、瘦素、抵抗素、内脂素及肿瘤坏死因子-α等多种脂肪细胞因子也参与了肝脏脂肪变性、炎细胞浸润及纤维化改变[2]。为深入研究其发病机制，有效地预防和治疗NAFLD，建立理想的能涵盖人体病理改变的动物模型极为重要。本文就近几年国内外常见的NAFLD动物模型的优缺点及最新研究进展做一综述，以期为根据不同实验目的选择相应的实验动物模型提供参考，且为以后建立更稳定的与人类病变更为相似的模型打下基础。目前，国内外用于科研的NAFLD动物模型主要有营养失调性模型、药物中毒性模型、基因敲除或基因突变性模型、复合性模型，兹介绍如下。

1 营养失调性脂肪肝模型

目前 ，营养失调性模型仍是最常见的NAFLD模型，即给予动物高脂、高糖饲料喂养建立的脂肪肝模型。其主要发病机理是营养过剩，食物中脂类、胆固醇或（和）糖类过量，无法完全吸收利用，脂类堆积于肝脏而引发脂肪肝，进一步出现炎症改变及纤维化。可建立营养失调性脂肪肝模型的动物种属很多，主要包括大鼠、小鼠 、家兔 、鸡 、猪等 ，其中大鼠最为常见 。

1.1 大 鼠

大鼠是建立脂肪肝动物模型最常用的动物种属。不同的饲料配方（高脂高糖饲料）均可成功建立非酒精性脂肪肝模型。

1.1.1 高脂饲料诱发模型

目前，国内外学者大多采用基础饲料加猪油或胆固醇或蛋黄喂养大鼠建立高脂饲料脂肪肝模型。刘云龙等[3]用基础饲料加15%猪油、13%鸡蛋黄粉、5%全脂奶粉和2%白砂糖喂养雄性SD大鼠12周，成功建立脂肪肝模型，并用此模型研究绿原酸对高脂饲料诱导非酒精性脂肪肝大鼠细胞凋亡相关基因表达的影响[3]。樊希承等[4]用含10%猪油、1%胆固醇、0.3%胆盐的高脂饲料喂养SD大鼠，7周后大鼠肝实质细胞发生脂肪变性，造模成功，并应用此模型观察脂肪肝的逆转状况，评价脂肪肝转归的影响因素，发现多数单纯性脂肪肝如能早期诊治，可以阻止脂肪肝的进一步发展并使其逆转，抗脂肪肝治疗好于自然恢复。此类模型存在的主要缺点是造模时间长、病变轻。但由于造模方法简便、重复性好、动物死亡率低且与临床高脂血症或肥胖引起的脂肪肝相似，造模停止后病变逆转缓慢便于药物干预研究，目前仍是国内外最常用的NAFLD模型。

此外，也有学者采用高脂液体饲料喂养大鼠造模，此种模型造模所需时间较大鼠自由进食高脂固体饲料短，发病机制与人体高脂血症引起的脂肪肝相似，但每天灌胃较为繁琐，且如操作不当易损伤动物食道或引起动物窒息死亡。

1.1.2 高糖饲料诱发模型

Kawasaki等[5]用富含果糖的饮食喂养5周龄的Wistar大鼠5周，肝细胞出现明显的大泡性脂肪变 、肝脏与体重的比值增加、肝脏甘油三脂浓度增加，造模成功，其形成机制与我国部分人群不良饮食习惯导致的脂肪肝类似。有不少学者采用禁食+高糖的方法建立脂肪肝模型，多将雄性Wistar大鼠禁食48 h后给予高糖饲料（双糖、淀粉），2 d后形成单纯性脂肪肝。该脂肪肝模型的形成可能与肝脏合成脂肪酸的循环失衡和甘油三酯的合成与分泌失衡有关。此模型具有造模时间短、成功率高、便于观察的特点；但最大的缺陷在于禁食48 h后再进食与人体自然发病机制不相符，也因此限制了其应用。

1.2 其他动物种属

除了大鼠，小鼠、家兔、鸡和猪也可用于建立NAFLD模型。尽管小鼠生命周期较短，不太适合长时间给药观察，但由于体型小，易于饲养和管理，仍有越来越多的高脂诱导小鼠脂肪肝模型被建立。Seung等[6]用两种脂肪含量不同（45%和60%）的高脂饲料喂养C57BL/6J小鼠建立脂肪肝模型，并研究一氧化氮合酶在脂肪肝模型中的分布情况，15周后成功建立NAFLD模型，且60%脂肪热量组的肝细胞小泡性脂肪变比45%脂肪热量组的更严重，同时观察到一氧化氮合酶在脂肪肝模型组中的分布比正常组多，这为后续的肥胖、糖尿病及NAFLD的进一步研究奠定了基础。此外，也有人用兔、鸡和猪建立营养失调性脂肪肝模型，有学者以高脂饲料喂养雄性新西兰家兔，建模成功[7]，这种模型体积大，适合临床影像学检查，这是其他小型动物不具有的特点；国外学者曾用高脂糊状饲料喂养3周龄的雄性白色来航鸡，6个月后鸡肝组织出现大、小泡混合性脂肪变性以及大范围的炎症浸润[8]，此种模型建模时间长，限制了其应用；有少数人用猪建立营养失调性NAFLD模型[9]，虽然猪与人类的NAFLD病史更为相似，但是饲养成本较高，目前应用也不多。

2 药物中毒性脂肪肝模型

目前国内外常用四氯化碳（CC14）、四环素、乙硫氨酸等药物建立中毒性非酒精性脂肪肝模型。

2.1 四氯化碳诱发模型

四氯化碳是最早用于建立中毒性脂肪肝模型的化学物质，是一种肝毒性药物，可造成急性肝损伤，其主要机制可能是通过诱导CYP2E1激活及严重脂质过氧化反应造成肝细胞结构和功能破坏。给予大鼠皮下注射四氯化碳0.5 mL/kg，每周3次，短时间内即可观察到中重度大泡性肝细胞脂肪变，伴炎症及坏死。此外，以四氯化碳灌胃也可建立脂肪肝模型，并在此基础上进行药物研究[10]。

2.2 四环素诱发模型

四环素是一种抗生素类化学药物，可用于诱发动物脂肪肝，主要通过干扰线粒体DNA复制、转录，影响线粒体脂肪酸β-氧化，继而造成肝细胞脂肪变性。Yin等[11]给2组雄性CD-1（ICR）BR Swiss大鼠一次性口服四环素0.1 g/kg或1 g/kg后，高剂量组大鼠在24 h即可见肝细胞小泡性脂肪变，并发现脂肪酸的β-氧化受抑制，也应用此模型做NAFLD基因方面的研究，其他学者采用腹腔注射四环素的方法也获得了类似结果[12]。

2.3 乙硫氨酸诱发模型

乙硫氨酸可使肝脏蛋白质合成发生障碍，进而使载脂蛋白的复合物生成减少，导致三酰甘油蓄积于肝脏，引起脂肪肝。Leclercq I等人给予白鼠腹腔注射乙硫氨酸0.02 mmol/kg/ d，连续7 d后处死白鼠，肝组织病理学切片显示出现了肝细胞小泡性脂肪病变。近年来，国内学者用乙硫氨酸灌胃的方法也成功建立小鼠脂肪肝模型[13]。

以上几种中毒性模型具有建模迅速、方法简便、病变明显的优点，但其发病机制、病理、病理生理改变与人体非酒精性脂肪肝差异较大，且多数药物毒性强，动物死亡率高，研究者可根据其研究目的和研究条件决定是否建立此类模型。

3 基因敲除或基因突变性脂肪肝模型

脂肪肝的形成不仅受饮食等环境因素的影响，也与遗传学因素密切相关，基因水平的变化可造成肝细胞脂肪变性。通过人为地对动物进行基因敲除或使其基因突变可建立非酒精性脂肪肝模型。

3.1 FLS小鼠模型

Soga等用同系交配的方法建立了一个新种系的小鼠，即FLS（fatty liver shionogi）小鼠，这种基因突变小鼠可自发形成脂肪肝，甚至发展成肝癌，但不伴有肥胖和糖尿病。新生 FLS小鼠肝细胞内含有大小不等的脂滴，随鼠龄增长，脂滴进行性增大，肝内甘油三酯（triglyceride，TG）的含量明显增加，达到正常小鼠的5倍，易自发形成肝细胞癌。杂交实验提示FLS小鼠的脂肪肝具有多基因特征，可用于研究肝脂肪变性进展成肝癌的病因和发病机制。

3.2 ADK-/-小鼠模型

Boison等用破坏腺苷激酶（adenosine kinase，ADK）基因的方法成功建立出生后致死性NAFLD模型。ADK-/-小鼠胚胎发育正常，出生后4 d即发生肝细胞小泡性脂肪变，并于2周内死亡。该模型建立所需时间短，但最大的缺陷在于模型是快速致死性的，不能用于药物疗效观察等方面的研究，实际应用受限。

3.3 ArKO小鼠模型

Chow等[14]通过敲除芳香酶基因Cyp9（aromatase knockout，ArKO）建立了小鼠脂肪肝模型[14]，研究发现雌激素α受体激动剂可改善小鼠脂肪肝变性。芳香酶基因Cyp9敲除后，小鼠不能合成内源性雌激素，导致腹腔内脂肪细胞的体积和数量显著高于野生型同窝鼠，提示雌激素在维持脂肪代谢中具有重要作用[15]。

3.4 肝细胞特异性PTEN缺陷小鼠模型

磷酸酶及强力蛋白同源蛋白（phosphataseandtensinhomologdetectedon chromosometen，PTEN）是一种位于10号染色体上的抑癌基因，是以磷酯酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3） 为基质的磷酸酶[16]，PTEN缺陷细胞表现为其生长和代谢亢进，易于癌变。Horie Y等[17]特异性敲除小鼠肝细胞PTEN基因，建立NAFLD模型，在此模型可见肝细胞脂肪变性和风帆样肿大、淋巴细胞及中性粒细胞为主的炎细胞浸润、旁窦状隙纤维化和出现Mallory小体等酷似人NAFLD的病理学改变[17]，重现“单纯性脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纤维化”的NAFLD自然经过。脂肪肝的形成与过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ及Akt-SREBP1c信号传导途径的激活和脂联蛋白（adiponectin）、脂肪细胞蛋白酶（adipsin）、激活蛋白2（activatorprotein 2）、脂肪酸合成酶（fattyacidsynthetase，FAS）以及乙酰辅酶A羧化 （acetyl-CoA carboxylase，ACC）等脂肪酸合成酶相关基因的表达增加有关；此外，氧化应激的增加可引起细胞膜脂质过氧化引发的肝细胞损害而造成脂肪性肝炎。由于此类模型复制出的NAFLD与人类病变极为相似，因此，近年来，该模型备受瞩目。大鼠与人类的同源性高于小鼠，如果未来对大鼠进行特异性PTEN基因敲除建立脂肪肝模型，其复制出的疾病与人类NAFLD将更加相似，对于研究其发病机制及防治也将更为有利。

尽管目前许多基因工程动物模型价格昂贵，但其能够从整体水平、组织器官水平及细胞和分子水平进行研究，为NAFLD的发病机制、药物筛选等研究提供比较理想的实验体系，未来诸如此类的模型将会越来越多。

4 复合脂肪肝模型

由于上述三类单一模型的发病机制和组织病理改变等疾病特征均与人体NAFLD存在一定差异。近年来，许多研究者联合应用营养、药物和基因诱发模型，以期使复合模型的疾病特征与人体NAFLD更接近，更能反映疾病从单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎进展，脂肪性肝炎向肝纤维化进展的过程。建立复合模型的常见方法包括:高脂饮食+四氯化碳[18]，ob/ob小鼠+蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食[19]，ApoE-/-小鼠+高脂饮食[20]，PPARα-/-小鼠+MCD饮食等，用这些方法均能复制出发病机制、病理组织学变化及发病经过与人类酷似的NAFLD模型。由于复合模型最大程度地模拟了人类NAFLD的复杂性，病理变化显著，是一种极具潜力的非酒精性脂肪肝模型。

5 几种非酒精性脂肪肝动物模型优缺点比较

不同致病因素所致脂肪肝动物模型的形成机制及病理改变各异，各有其优点和缺陷。

营养失调性模型建模方法简便、重复性好，与人类NAFLD的致病机制相似，能出现胰岛素抵抗、代谢综合征等全身代谢紊乱表现，肝脏病变多具有渐进性发展的特点，但建模所需时间较长；药物中毒性模型建模迅速、方法简便、病变明显，但其发病机制、病理改变与人体NAFLD差异较大，且药物毒性强，动物死亡率高；基因敲除或基因突变性模型能自发形成脂肪肝，且伴肥胖、胰岛素抵抗等代谢综合征，能从整体水平、组织器官水平及细胞和分子水平进行研究，但价格昂贵，且部分模型缺乏NAFLD的自然演变过程；复合模型能最大程度地模拟人类NAFLD的复杂性，病理变化显著，其不足在于与单一模型相比，建模过程稍复杂。

6 展 望

经过国内外研究者数十年的努力，NAFLD动物模型的研究有了很大进展，许多模型已用于NAFLD发病机理、药物疗效观察、临床影像学等研究，且在基础和临床领域均取得一定成绩。好的NAFLD动物模型应具有以下特点：符合人类脂肪肝发病机制、形成过程及病变特征，建模快，动物死亡率低，复制率高，重复性好，方法简便。许多复合模型虽然能很大程度地反映NAFLD“单纯性脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纤维化”的典型疾病过程，但至今仍缺乏能完全涵盖人类NAFLD疾病特征的单一动物模型。今后的研究应在完善已有模型的基础上，更多地致力于基因工程模型的改造和建立，探索新的造模方法，使动物模型更贴近人类NAFLD的特点，以期对疾病进行更深入的研究，阐明其发病机制，更好地防治NAFLD。

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（2015-11-05收稿）

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A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.031

喻 琴（1991-），女，硕士生，E-mail：534138116@qq.com。