风湿性心脏病二尖瓣组织Th17细胞轴相关细胞因子表达水平

文　韵　桂　春　黄伟强　文　宏　韦　恒　郑慧蕾　曾志羽

(广西医科大学第一附属医院老年心内科，广西　南宁　530021)



风湿性心脏病二尖瓣组织Th17细胞轴相关细胞因子表达水平

文韵桂春1黄伟强文宏韦恒郑慧蕾曾志羽

(广西医科大学第一附属医院老年心内科，广西南宁530021)

摘要〔〕目的探讨慢性风湿性心脏病(RHD)患者心脏二尖瓣瓣膜上Th17细胞轴相关细胞因子白细胞介素(IL)-17、IL-21、IL-6、IL-23表达水平的改变。方法选择 20例 RHD患者及12例非RHD对照组二尖瓣瓣膜组织(NRHD组)，应用苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化法对IL-17、IL-21、IL-6、IL-23表达水平进行检测。结果RHD组HE染色可见瓣膜组织部分出现纤维化和钙化，局灶性散在的慢性炎性细胞浸润，以淋巴细胞、浆细胞为主。免疫组织化学染色可见慢性炎性细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞存在IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表达且定位于细胞质中，炎性细胞主要位于血管旁。RHD组 IL-17、IL-21、IL-6、IL23表达阳性细胞比例及其乘积评分均明显高于NRHD组(P<0.05)。结论RHD患者瓣膜中Th17细胞相关细胞因子的表达明显增高，高Th17表达可能是引起RHD持续瓣膜损害的一个潜在机制。

关键词〔〕风湿性心脏病；Th17细胞；细胞因子

1广西医科大学第一附属医院西院心内科

第一作者：文韵(1990-)，女，在读硕士，主要从事风湿性心脏病、冠心病方面的研究。

风湿性心脏病(RHD)是A组β溶血性链球菌感染引起的风湿热(RF)的后遗症，是一种自身免疫性疾病〔1〕，并与细胞因子相关联〔2,3〕。Th17细胞作为最新被确认的效应细胞系，在防御细胞外细菌感染、介导慢性炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用。越来越多的研究证明，Th17细胞参与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、哮喘等〔4～6〕多种自身免疫性疾病的病理过程。但是Th17细胞及其效应因子在RHD中的表达目前尚未完全明确。本文拟初步探讨Th17细胞在慢性RHD中的作用，为进一步阐明和完善RHD的发病机制提供依据。

1材料和方法

1.1材料来源随机选取广西医科大学第一附属医院2013年10月至2014年3月行二尖瓣置换术的RHD患者20例为RHD组，男8例，女12例，年龄(50.30±1.786)岁。另外选取12例非RHD行二尖瓣置换术(退行性二尖瓣后瓣脱垂)患者二尖瓣前瓣瓣叶作对照(NRHD组)，男6例，女6例，年龄(58.58±2.204)岁。两组选取病例均通过心脏超声确诊。本实验所选取人体标本均通过病人及其家属知情同意。兔抗人白细胞介素(IL)-17、IL-6、IL-23单克隆抗体采用Abcam公司产品，兔抗人IL-21单克隆抗体采用Novus公司产品，S-P免疫组化试剂盒采用北京中杉金桥公司产品，DAB显色试剂盒采用福州迈新公司产品。

1.2标本制备两组均在术中建立体外循环,心脏停跳后30 min内取材，立即放入4%多聚甲醛固定16 h后，移入脱钙液中，浸泡至组织脱钙软化，常规石蜡包埋,连续切片厚4 μm,作苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。

1.3HE染色和免疫组化将石蜡切片进行HE染色，观察炎症细胞浸润和组织学形态。同时石蜡切片常规脱蜡水化，抗原修复后再加入3%H2O2去离子水去除内源性过氧化物酶，置于正常山羊血清工作液中，室温下封闭15 min，加入上述各单克隆抗体，4℃过夜后加入生物素标记山羊抗兔IgG抗体。上述每级抗体孵育后，使用PBS充分洗涤。DAB室温下显色5～10 min后，苏木素染核、脱水、透明、封片，显微镜下观察并计数。

1.4结果判定IL-17、IL-21、IL-6、IL-23均以细胞质内出现不同程度的棕黄色判定为阳性反应。以PBS取代一抗作为空白对照。采用许良中等〔7〕的半定量公式判断染色结果。随机选取5个典型高倍镜视野(400倍)计数每个视野下细胞总数和阳性细胞的个数。首先就染色强度打分，以多数细胞呈现的染色特性(染色深浅的判定需要与背景着色深浅相比较)计分：棕褐色判为3分，棕黄色判为2分，浅黄色判为1分，无着色判为0分；再将阳性细胞所占百分比打分，阳性细胞比例的计算方法：阳性细胞/总细胞数×100%。0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞11%～50%，3分为阳性细胞51%～75%，4分为阳性细胞≥75%。阳性细胞的百分比与染色强度的乘积>3分为免疫反应阳性。

1.5统计学处理采用SPSS16.0软件行t检验。

2结果

2.1HE染色RHD组HE染色结果可见瓣膜组织部分出现纤维化和钙化，局灶性散在的慢性炎性细胞浸润，以淋巴细胞、浆细胞为主，见图1。

2.2免疫组化染色慢性炎性细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞存在IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表达且定位于细胞质中，炎性细胞主要位于血管旁，见图2、图3。RHD组 IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表达阳性细胞比例及其乘积评分均明显高于NRHD组(P<0.05)，见图4。

图1　两组患者二尖瓣膜病理HE染色(×400)

图2　两组患者心瓣膜IL-17、IL-21免疫组化表达(DAB，×400)

图3　两组患者心瓣膜IL-6、IL-23免疫组化表达(DAB，×400)

与NRHD组比较：1)P<0.05图4　两组IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表达

3讨论

本文发现， Th17细胞自分泌的细胞因子IL-17和IL-21在人类慢性RHD瓣膜中的表达与对照组相比明显增加，同时促进Th17细胞分化的正向调节因子IL-6和IL-23与对照组也存在差异。本研究证实所有患者风湿活动属于慢性稳定期，表明该Th17细胞的表达不是由链球菌急性感染引起的，在慢性RHD疾病稳定期，Th17细胞造成的自身免疫损害占主要优势。同时，在慢性RHD瓣膜中，Th17相关细胞因子在炎症细胞上的表达为局灶性的分布，这与Guilherme等〔3〕的研究结果风湿性病变瓣膜组织有慢性炎症和炎性细胞局灶浸润相一致。

Wang等〔8〕的研究显示，β链球菌感染诱导的组织生长因子(TGF)-β1和IL-6，有助于CD4+T细胞向Th17细胞系的发育。在他们的研究中，Th17细胞的免疫是被动转移到裸鼠中去的，并且显示对抗链球菌的保护性免疫依赖于Th17细胞系。我们的研究结果也证实，促进Th17细胞分化的正向调节因子IL-6、IL-23在瓣膜中表达明显增加，可以认为 IL-6和IL-23表达升高可能促进了Th17细胞的分化。Th17细胞在对抗链球菌和导致自身免疫是必需的。最近，Bas等〔9〕报道，风湿性心脏病患者外周Th17细胞的百分比和血清中Th17/Treg的比例显著升高。Guilherme等〔10〕通过分析来源于慢性RHD患者外周T细胞中的IL-17A基因表达，发现来源于RHD患者的外周T细胞表现出IL-17A过表达，他们还阐述发现大量的IL-17和IL-23存在于心瓣膜细胞中〔11〕。根据以上研究推测，在风湿性心脏病早期，易感个体中反复的链球菌暴露连同长期和过度的Th17反应可能引发心瓣膜炎，而在风湿性心脏病的晚期，Th17细胞介导的自身免疫作用持续加重了心脏瓣膜的损害。但这一假设还需要进一步的评估。

由于RHD病因复杂、影响因素较多以及动物模型建立困难等，目前并没有特别的治疗能够有效防止RHD的进展。在全球范围内，每3～4 w肌内注射苄星青霉素G(BPG)的二级预防仍被推荐〔12〕。然而，二级预防的效果是有限的，因为全球BPG的供应量和质量存在差异，且患者每3～4 w注射BPG的依从率较低〔13〕。因此，需要新的策略防止急性RF的复发以及RHD的进展。本研究也存在一定的局限性，仅仅使用免疫组化的方法检测Th17部分相关细胞因子的表达，且只是研究了在RHD慢性期瓣膜的改变，未研究急性期瓣膜的改变，这也是我们将来研究的内容。

参考文献4

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2王萍.细胞因子在风湿性心脏病发生发展中的作用〔J〕.国际免疫学杂志,2006;29(1):40-3.

3Guilherme L,Cury P,Demarchi LM,etal.Rheumatic heart disease:proinflammatory cytokines play a role in the progression and maintenance of valvular lesions〔J〕.Am J Pathol,2004；165(5):1583-91.

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7许良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准〔J〕.中国癌症杂志,1996;6(4):229-31.

8Wang B,Dileepan T,Briscoe S,etal.Induction of TGF-beta1 and TGF-beta1-dependent predominant Th17 differentiation by group A streptococcal infection〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2010;107(13):5937-42.

9Bas HD,Baser K,Yavuz E,etal.A shift in the balance of regulatory T and T helper 17 cells in rheumatic heart disease〔J〕.J Investig Med,2014;62(1):78-83.

10Guilherme L,Kalil J.Rheumatic fever and rheumatic heart disease:cellular mechanisms leading autoimmune reactivity and disease〔J〕.J Clin Immunol,2010;30(1):17-23.

11Guilherme L,Kalil J.Rheumatic heart disease:molecules involved in valve tissue inflammation leading to the autoimmune process and anti-S.pyogenes vaccine〔J〕.Front Immunol,2013;4:352.

12王健,全瑛,吉健华,等.TGF-β1通过抑制HIF-1α减少风湿性心脏病心肌细胞胶原合成〔J〕.现代生物医学进展,2014；14(34):6634-6,6617.

13Remenyi B,Carapetis J,Wyber R,etal.Position statement of the World Heart Federation on the prevention and control of rheumatic heart disease〔J〕.Nat Rev Cardiol，2013;10(5):284-92.

〔2014-12-27修回〕

(编辑徐杰)

通讯作者：曾志羽(1965-)，男，教授，主要从事风湿性心脏病、冠心病方面的研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81260067)；广西科学研究与技术开发计划项目(桂攻科1355005-4-4)

中图分类号〔〕R593.21〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0061-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.026