山腊梅提取物对慢性阻塞性肺病大鼠炎症细胞、C反应蛋白、白细胞介素-8水平的影响

汤　森　胡建军　刘　多　彭　霞　迪丽沙·迪力夏提　彭英福

(吉首大学医学院，湖南　吉首　416000)



山腊梅提取物对慢性阻塞性肺病大鼠炎症细胞、C反应蛋白、白细胞介素-8水平的影响

汤森胡建军刘多彭霞迪丽沙·迪力夏提彭英福

(吉首大学医学院，湖南吉首416000)

摘要〔〕目的观察山腊梅茎水提物对慢性阻塞性肺病(COPD)模型大鼠炎症细胞和C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-8的影响。方法采用反复烟熏加内毒素气管内滴入法复制COPD大鼠模型，将60只SD大鼠随机分为五组：正常组、模型组和低、中、高剂量山脂梅组。模型组及正常组给予生理盐水灌胃，山腊梅组分别给予低、中、高剂量进行灌胃，疗程21 d。观察各组大鼠肺组织的病理学改变，测定各组支气管肺泡灌洗液白细胞计数、中性粒细胞比率及各组血清和肺组织中CRP、IL-8水平。结果模型组大鼠出现慢性支气管炎特征性病理改变明显，气管及血管周围有大量炎症细胞浸润，肺气肿明显，低、中、高剂量治疗组肺气肿和炎症浸润较模型组有明显减轻，正常组大鼠肺组织结构基本正常。模型组大鼠肺组织和血清CRP、IL-8较正常对照组显著增多，高、中、低剂量山腊梅组大鼠肺组织和血清CRP、IL-8均明显较模型组减少(P<0.05)。模型组中白细胞总数及中性粒细胞比率较各山腊梅组增加(P<0.01)，各山腊梅组白细胞计数及中性粒细胞较正常组明显增多(P<0.01)。结论山腊梅茎水提物可降低COPD大鼠肺组织和血清中CRP及IL-8水平，对COPD大鼠的炎症有抑制作用。

关键词〔〕C-反应蛋白；慢性阻塞性肺病；山腊梅茎水提物；支气管肺泡灌洗液

第一作者：汤森(1993-)，男，在读硕士，主要从事民族药物教学与研究。

山腊梅叶具有抗菌消炎、止咳化痰、清热排毒、抗病毒、助消化、止泻、减肥、消脂降压、预防心脑血管疾病以及增强机体免疫力等作用，对其作用机制的研究提示山腊梅叶可减少肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素(IL)-8、IL-10等生成〔1〕。对山腊梅的药理基础研究及其开发仍局限于山腊梅叶，而对山腊梅茎、花、根的药理学研究未见报道。长期以来，山腊梅对慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗缺乏深入研究。本研究探讨山腊梅茎对COPD大鼠炎症的影响及其作用机制。

1材料和方法

1.1山腊梅茎水提物的提取在湘西吉首地区采集山腊梅，由我院中药学李春艳教授鉴定。称取阴干后的山腊梅茎1 000 g，粉碎，约60℃水提3次，每次120 min，合并水煎液，浓缩为1 g生药/ml，得到山腊梅茎水提物。

1.2实验动物与分组清洁级SD大鼠60只，雌雄兼用，湖南长沙市开福区东创实验动物科技服务部购买，动物编号HNACSDC20120292，鼠龄13 w，体重(280±20) g。随机分为：正常组(n=12)、模型组(n=12)和低剂量山腊梅组(n=12)，中剂量山腊梅组(n=12)、高剂量山腊梅组(n=12)。实验中大鼠死亡3只，进入统计动物数实为57只。

1.3COPD模型制备方法采用两次气管内注入脂多糖(LPS)和反复烟熏的方法制作COPD大鼠模型。第1、14天浅麻醉后向气管内缓慢注入脂多糖200 μg (200 μl)/只，将大鼠放入自制的有机玻璃染毒箱(120 cm×100 cm×100 cm)内，在其正下方开一个4 cm×2 cm的通气孔。将烟叶点燃后放入烟熏箱中(烟叶购于吉首农贸市场)，大鼠每天吸烟2次，每次烟叶用量250 g，时间30 min，2次间隔4 h，连续28 d。用药组：大鼠吸烟染毒8 d后每天吸烟染毒前予以山腊梅茎水提物灌胃(低剂量组原药0.5 ml+生理盐水1.5 ml/每次，中剂量组原药1 ml+生理盐水0.5 ml/每次，高剂量组原药2 ml/每次)至造模结束，共20 d。正常组气管内滴入等量生理盐水及2 ml/d生理盐水灌胃，28 d天后处死大鼠用于实验观察。

1.4血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)的采集将大鼠用2%的戊巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉后仰卧固定于操作台，切开胸部，暴露出气管和双肺，从颈总动脉插管取血后，3 500 r/min，离心10 min，取上清液血清于-85℃低温冰箱保存。结扎右主支气管，在隆突上用套管针穿刺至左肺，缓慢注入无菌生理盐水3 ml，每次注入后立即回吸得到BALF，重复3次。灌洗液纱布过滤，回收率为60%～70%，混匀灌洗液做白细胞计数和中性粒细胞计数比率测定。

1.5肺组织匀浆制备取适量肺组织，冰生理盐水漂洗两次，滤纸吸干、称重、剪碎，加入9倍冰生理盐水，超声匀浆器制成10%匀浆，低温离心机4 000 r/min离心10 min，取上清液，置于-85℃冰箱中保存至生化指标检测。

1.6病理学检查实验各组于吸烟染毒结束后取每只大鼠右中叶肺组织，10%中性福尔马林固定后，常规石蜡包埋切片，HE染色。在400倍光镜下，随机选取5个视野，根据文献〔2〕对气道炎症进行病理学评分。病理学检查由湘西州人民医院病理科进行，采用单盲法。

1.7血清和肺组织匀浆中C-反应蛋白(CRP)、IL-8水平检测利用H6000-020全自动生化分析仪，大鼠CRP试剂盒、IL-8试剂盒购于武汉博士德生物有限公司，严格按照说明书操作步骤进行检测。

2结果

2.1一般情况实验前各组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)，造模开始后模型组大鼠食量下降、活动减少，毛色暗黄，出现慢性咳、喘症状，体重较正常组显著减轻(P<0.01)；给药组较模型组进食增多，咳、喘减轻，活动增多，体重增加，但仍不及正常组(P<0.01)(表1)。

表1　各组大鼠体重比较

与实验后正常组比较：1)P<0.01；与实验后模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；与中剂量山腊梅组比较：4)P<0.01

2.2病理改变大体观察，模型组大鼠肺较正常组颜色苍白，体积增大；镜检结果(图1)：正常组大鼠肺组织未见明显异常改变，模型组大鼠血管充血明显并累及周围肺泡，肺泡腔明显扩张，肺泡壁出现断裂，气道壁及管腔内有大量炎性细胞渗出，黏液渗出阻塞气道，支气管黏膜上皮脱落、坏死。低、中及高剂量山腊梅组大鼠的支气管充血、黏膜上皮脱落、炎性细胞浸润以及肺泡腔扩大情况较模型组减轻，较正常组重。气道炎症病理学总评分模型组高于正常组(72.5±13.9 vs 13.6±2.6，P<0.000 1)，山腊梅干预后病理评分下降，(低、中、高剂量山腊梅组评分分别为51.6±14.7、46.8±11.3、37.9±9.5)但仍高于正常组(P<0.05)。

2.3各组大鼠BALF白细胞总数及中性粒细胞比率模型组中白细胞总数增加，与正常组比较差异显著(P<0.01)。各山腊梅组炎症细胞总数较模型组明显减少(P<0.01)。与正常组比较，模型组和各山腊梅组中白细胞总数和中性粒细胞比率均显著升高，与模型组比较，各山腊梅剂量组白细胞总数和中性粒细胞比率均显著下降，并呈一定的剂量效应关系(P<0.01)(表2)。

模型组

正常组

低剂量山腊梅组

中剂量山腊梅组

高剂量山腊梅组

表2　各组大鼠BALF白细胞总数、中性粒细胞比率比较±s)

与模型组比较:1)P<0.01；与高剂量山腊梅组比较：2)P<0.01；与中剂量山腊梅组比较：3)P<0.01；下表同

2.4血清中CRP、IL-8的测定模型组血清CRP明显较正常组增多(P<0.01)。高、中、低剂量山腊梅组血清CRP均较模型组明显减少(P<0.05或0.01)。低、中剂量山腊梅组间血清CRP水平无明显差异(P>0.05)，高与低剂量山腊梅组比较，差异显著(P<0.05)(表3)。

表3　各组大鼠血清CRP、IL-8水平比较

2.5各组大鼠肺组织匀浆中CRP、IL-8的测定模型组大鼠肺组织CRP、IL-8明显较正常组增多(P<0.01)。各山腊梅组肺组织CRP、IL-8均明显较模型组减少(P<0.05)。低、中剂量山腊梅组间血清CRP、IL-8水平无明显差异(P>0.05)。高低剂量山腊梅组比较差异显著(P<0.05)(表4)。

表4　各组大鼠肺组织匀浆中CRP、IL-8比较

3讨论

吸烟和反复下呼吸道感染是COPD发生发展的主要原因〔3〕。本实验通过熏吸香烟加气管内注射LPS法建立COPD大鼠模型，结果符合COPD病理改变，说明造模成功，且山腊梅对COPD的气道炎症有一定的缓解作用。

气道炎症(尤其是小气道的炎症)是COPD的基础性病变，以中性粒细胞为主〔4〕的气道炎症在其发病过程中起着非常重要的作用。中性粒细胞在COPD气道腔内聚集增加，并通过释放蛋白酶如基质金属蛋白酶、氧自由基等引起组织损伤 参与COPD 气流阻塞的形成。IL-8在中性粒细胞激活的过程中起着重要的作用，它可以激活中性粒细胞多方面的功能，可以作为评估呼吸道炎症和受损程度的一个指标。在COPD发病过程中，IL-8在中性粒细胞所致炎症中起了相当重要的作用，IL-8水平与气流阻塞程度、气道的炎症相匹配〔5〕。本研究提示中性粒细胞的活化和聚集是慢性支气管炎与肺气肿炎症过程的一个重要环节，利用山腊梅干预后，中性粒细胞明显减少，提示该药物对烟熏加脂多糖诱发大鼠COPD模型有显著减少白细胞数量的作用，呈现一定的剂量效应关系。本实验说明山腊梅水提物能降低慢性阻塞性大鼠血清及肺组织中IL-8的表达，减少炎性细胞因子的释放，从而控制气道炎症。

CRP是一种对多种刺激因素包括感染、组织损伤、坏死都能迅速发生反应的蛋白，常可作为一种反应炎症、组织损伤程度以及评价治疗反应的非特异性敏感指标〔5〕。本实验结果提示CRP不仅对COPD具有慢性表达，是COPD病情的重要生物学标志，且山腊梅对大鼠COPD模型大鼠的抗炎作用与减少COPD病变中IL-8及CRP有关。

参考文献4

1李莎莎，舒任庚.山腊梅化学成分及药理作用的研究进展〔J〕.华西药学杂志，2009;24(2):198-200.

2Lee SY，Park KH，Oh KJ，etal.The relationship of serum C-reactive protein and clinical chorioamnionists，funisitis，and early onset neonatal sepsis in preterm delivery 〔J〕.Am J Obstet Gynecol，2011;204：S210.

3周新.COPD发病机制研究进展〔J〕.临床肺科杂志,2001;93(6):47-8.

4Gallelli L，Pelaia G，Fratto D，etal.Effects of budesonideon P38MAPK activation，apoptosis and IL-8 secretion，induced by TNF alpha and H aemophilus influenzae in human bronchial epithelial cells〔J〕.Int J Immunopathol Pharmacol，2010;23(2)：471-9.

5Dulay A，Buhimsch I，Zhao GM，etal.Systematic evaluation of prototype acute phase reactants 〔Interleukin-6(IL-6)，C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT)〕 as non-invasive biomarkers of intra-amniotic infection (IAI)〔J〕.Am J Obst Gynecol，2011;204：S248.

〔2014-08-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：彭英福(1968-)，男，硕士，讲师，主要从事民族药物教学与研究。

基金项目：湖南省教育厅大学生创新性课题基金资助(湘教通〔2012〕141号)；吉首大学 (JSU-CX-2012-44)

中图分类号〔〕R361；R932〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0026-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.011