丝胶对糖尿病大鼠肾脏血小板衍生生长因子表达的调控作用

赵春颖　刘东慧　宋成军　陈志宏

(承德医学院中药研究所，河北　承德　067000)



丝胶对糖尿病大鼠肾脏血小板衍生生长因子表达的调控作用

赵春颖刘东慧1宋成军1陈志宏1

(承德医学院中药研究所，河北承德067000)

摘要〔〕目的观察丝胶对2型糖尿病大鼠肾脏血小板衍生生长因子(PDGF)表达的调控作用。 方法健康成年雄性SD大鼠48只，随机分为正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和阳性对照组(n=12)。链脲佐菌素腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，丝胶治疗组大鼠按照2.4 g·kg-1·d-1的剂量灌胃给予丝胶、阳性对照组大鼠按照55.33 mg·kg-1·d-1的剂量灌胃给予二甲双胍。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠血清Ⅰ型胶原的含量；Western 印迹和RT-PCR法检测各组大鼠肾脏PDGF蛋白和mRNA的表达。 结果丝胶治疗组较糖尿病模型组血清Ⅰ型胶原的含量、肾脏PDGF蛋白和mRNA的表达明显降低(P<0.01，P<0.05)。结论丝胶可通过下调糖尿病大鼠肾脏PDGF的表达，恢复肾脏细胞外基质代谢的平衡，从而发挥对糖尿病肾脏损伤的保护作用。

关键词〔〕2型糖尿病；肾脏；丝胶；细胞外基质；血小板衍生生长因子

1承德医学院人体解剖学研究室

第一作者：赵春颖(1972-)，女，副研究员，硕士，主要从事中药研究。

血小板衍生生长因子(PDGF)是一种重要的促细胞生长因子〔1〕，并参与肾脏细胞外基质(ECM)的代谢〔2〕。有研究发现，PDGF与糖尿病肾病的发生发展密切相关，可参与早期糖尿病肾脏损伤的发生和肾脏硬化〔3〕。丝胶是蚕茧中约占30%的水溶性蛋白质，我国民间早就有糖尿病病人将蚕茧泡水饮用用于辅助降血糖。为丰富丝胶治疗糖尿病及其并发症的实验研究，本研究观察丝胶是否可通过调控肾脏PDGF的表达，调节肾脏ECM代谢，进而保护糖尿病时的肾脏损伤。

1材料与方法

1.1实验动物分组及处理48只清洁级健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，购自河北医科大学实验动物中心，合格证号：712024。随机选取其中的12只作为正常对照组，常规饲养，腹腔注射同等剂量链脲佐菌素(STZ)溶剂(枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH4.4)3次(1次/d)；其余的36只大鼠按25 mg/kg的剂量连续3 d腹腔注射2%，成模标准是注射STZ 1 w后空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L〔4〕。成功建立2型糖尿病模型的大鼠随机分为糖尿病模型组、丝胶治疗组和阳性对照组，每组12只，丝胶治疗组大鼠按照2.4 g·kg-1·d-1的剂量灌胃给予丝胶35 d，阳性对照组大鼠灌胃给予二甲双胍(55.33 mg·kg-1·d-1)35 d，正常对照组、模型组大鼠灌胃给予等容积生理盐水35 d。

1.2药物和试剂丝胶(自制)：蚕茧(承德医学院蚕业研究所提供)浸泡后水煎2次，合并滤液并浓缩。STZ，美国Sigma公司，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配制；血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司；Ⅰ型胶原酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，上海瑞奇科技有限公司；兔抗PDGF-B多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；辣根酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)，美国KPL公司；BCA蛋白定量试剂盒、蓝色预染蛋白质Marker、蛋白裂解液、1 200 bp DNA Ladder，北京泰格美科技有限公司；β-actin单克隆抗体，美国Santa公司；Trizol，美国Invitrogen公司；PDGF、β-actin引物，上海生工公司；PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。

1.3检测血液指标4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经内眦取血，3 000 r/min离心20 min后收集血清，-20℃冰箱保存。葡萄糖氧化酶法检测血糖，ELISA法检测Ⅰ型胶原的含量。

1.4大鼠肾脏PDGF表达的检测大鼠取血后断头处死，取肾脏入液氮保存。

1.4.1Western 印迹法检测PDGF蛋白的表达取液氮保存肾脏提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。每个上样孔加80 μg总蛋白行12% SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉37℃封闭1h，加一抗(β-actin 1∶1 000、PDGF 1∶200)于4℃过夜；洗膜后加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温摇床孵育1 h，洗膜后加入Super ECL Plus超敏发光液，曝光后扫描。以β-actin为内参照，采用Quantity One-v 4.6.2软件对Western条带进行定量分析，以目的蛋白与β-actin条带的灰度比值，作为各目的蛋白的相对表达水平。

1.4.2RT-PCR法检测PDGF mRNA的表达取液氮保存肾脏，按Trizol试剂说明提取肾脏总RNA，并反转录成cDNA，产物进行PCR。PCR引物序列、扩增条件及产物长度见表1。PCR反应体系50 μl，反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸1 min，第2步起循环。取5 μl扩增产物及5 μl DNA Ladder行2%琼脂糖凝胶电泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析仪摄像，应用Quantity One-v 4.6.2软件进行分析，以目的条带和β-actin条带吸光度的比值，作为PDGF mRNA的相对表达水平。

1.5统计学方法采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和q检验。

2结果

2.1各组大鼠的血糖和血清Ⅰ型胶原的含量与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠的FPG、Ⅰ型胶原的含量明显升高(P<0.01)；与糖尿病模型组大鼠比较，丝胶治疗组、阳性对照组大鼠的FPG和Ⅰ型胶原的含量明显降低(P<0.01，P<0.05)。见表2。

表1　PCR引物序列及扩增条件

表2　各组大鼠FPG、Ⅰ型胶原含量和肾脏PDGF的表达

与糖尿病模型组比较：1)P<0.01,2)P<0.05

2.2各组大鼠肾脏PDGF的表达糖尿病模型组大鼠肾脏PDGF蛋白及mRNA的表达较正常对照组大鼠高(P<0.01)；丝胶、二甲双胍均可明显降低糖尿病模型大鼠肾脏PDGF的表达，丝胶治疗组、阳性对照组大鼠肾脏PDGF蛋白及mRNA的表达明显较糖尿病模型组大鼠低(P<0.01)。见图1，图2和表2。

1.正常对照组，2.糖尿病模型组，3.丝胶治疗组，4.阳性对照组；下图同图1　各组大鼠肾脏PDGF蛋白的表达

图2　各组大鼠肾脏PDGF mRNA的表达

3讨论

糖尿病肾病的主要病理特征是系膜区ECM的进行性积聚，进而引发肾小球硬化、肾间质纤维化，最终导致慢性肾衰竭甚至死亡。机体内多种细胞因子和酶参与调节ECM合成与分解的动态平衡，包括PDGF。糖尿病时，由于高血糖诱导激活PKC途径、脂代谢紊乱以及晚期糖基化终末产物(AGEs)的刺激，使肾脏PDGF的表达水平升高〔5,6〕。PDGF表达水平升高，可通过直接促进多种ECM成分的积聚，参与早期糖尿病肾脏损伤的形成和肾小球硬化〔7,8〕；另外，PDGF还可通过诱导TGF-β的表达加重肾脏病变，并且这一作用与高血糖有协同效应，由此引发肾小球系膜细胞增生和ECM积聚〔9,10〕。Kang等〔11〕研究发现，通过抑制PDGF基因启动子区Sp1的表达，可减轻系膜细胞增生和系膜基质的产生。

丝胶可通过下调PDGF的表达，一方面，减弱PDGF直接促进ECM成分产生的作用，另一方面，可拮抗PDGF诱导的TGF-β的致肾脏纤维化的作用，通过减少ECM合成恢复ECM的平衡，延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的发生发展，发挥对糖尿病肾脏损伤的保护作用。

我国糖尿病患者以药物治疗为主，但各种药物均有不同程度的不容忽视的副作用，且无法有效改善胰岛素抵抗及保护胰岛细胞〔12,13〕。因此，需要探寻一种降糖疗效可靠且较少毒副作用的治疗糖尿病的中成药。丝胶是蚕丝中由18种氨基酸组成的高分子水溶性蛋白质，是天然的蛋白质，可避免化学合成药物带来的毒副作用，且本课题组的前期研究发现，丝胶可保护糖尿病时生殖功能障碍和脊髓损伤〔14,15〕。

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12Kang JH,Chae YM,Park KK,etal.Suppression of mesangial cell proli- feration and extracellular matrix production in streptozotocin-induced diabetic rats by Sp1 decoy oligodeoxynucleotide in vitro and in vivo〔J〕.J Cell Biochem,2008;103(2):663-74.

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〔2014-03-18修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

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Regulating effects of sericin on platelet-derived growth factor expression in kidney of type 2 diabetes mellitus rats

ZHAO Chun-Ying,LIU Dong-Hui,SONG Cheng-Jun,etal.

Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the regulating effects of sericin on platelet-derived growth factor (PDGF) expression in kidney of type 2 diabetes mellitus rats. Methods48 adult healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups with 12 rats in each group: normal control,diabetes mellitus model,sericin treatment and positive control groups.Type 2 diabetes mellitus rat model was made by injecting streptozotocin into the peritoneal cavity continuously,and then the rats were respectively lavaged with sericin (2.4 g/kg) in sericin treatment group and metformin (55.33 mg/kg) in positive control group.Serum type Ⅰ collagen content was detected by ELISA.Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of PDGF in kidney. ResultsCompared with rats in diabetes mellitus model group,serum type Ⅰ collagen content of rats in sericin treatment group was decreased obviously.Expression of PDGF of rats' kidney was decreased significantly in sericin treatment group (P<0.01,P<0.05). ConclusionsSericin can recover the balance of extracellular matrix metabolism by down regulating the expression of PDGF in kidney of diabetes mellitus rats,so to protect kidney injury during diabetes mellitus.

【Key words】Type 2 diabetes mellitus; Kidney; Sericin; Extracellular matrix; Platelet-derived growth factor

通讯作者：陈志宏(1971-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事糖尿病及其并发症防治研究。

基金项目：国家自然科学 (81441133)；河北省自然科学 (H2012406018)

中图分类号〔〕R587.1〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0007-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.003