缺氧预处理对老年大鼠运动性骨骼肌损伤的作用及机制

邓文骞　王　璐

(成都体育学院运动医学系，四川　成都　610041)



缺氧预处理对老年大鼠运动性骨骼肌损伤的作用及机制

邓文骞王璐

(成都体育学院运动医学系，四川成都610041)

摘要〔〕目的了解缺氧预处理对老年大鼠运动性骨骼肌损伤发生发展的影响。方法将老年雌性SD大鼠随机分为对照组(CON)组、大强度离心跑台运动组(EE)组、缺氧预处理+离心跑台运动组(HCP)组，4月龄大鼠作为成年对照组(ADU)组。HCP组大鼠进行1 w的缺氧预处理。将EE组及HCP组大鼠进行一次性大强度离心跑台运动后处死，测定血清白细胞介素(IL)-6含量、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量，石蜡切片观察肌纤维细微结构；取肌肉匀浆测超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。结果EE组及HCP组大鼠运动后均出现骨骼肌损伤现象，EE组损伤较HCP组严重。与EE组相比，HCP组血清IL-6、CK及LDH水平明显降低，比目鱼肌MDA水平明显降低，SOD活性明显升高。结论缺氧预处理可提高老年大鼠骨骼肌的抗氧化能力，降低骨骼肌损伤后炎性反应，对运动性骨骼肌损伤有预防作用。

关键词〔〕运动性骨骼肌损伤;比目鱼肌;缺氧预处理;离心运动

第一作者：邓文骞(1982-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事运动疲劳及运动损伤的防治研究。

运动性肌肉损伤(EIMD)是指机体从事不习惯高强度和或长时间运动后发生的骨骼肌纤维微细损伤〔1〕。导致EIMD的原因之一可能是剧烈运动导致机体的氧化应激反应增加，通过增加机体抗氧化能力能够减少EIMD的发生〔2〕。而老年人随着年龄的增加，机体抗氧化能力逐渐下降，发生EIMD的风险也在逐渐增加，如何有效预防EIMD的发生，减少运动锻炼带来的负面影响，成为老年运动医学的研究热点。近年来的研究发现，预先短暂的缺血或轻度缺氧可激发机体内源性保护机制，对随后的严重缺血、缺氧具有预防和保护作用，其机制可能是缺血/缺氧预处理调动了机体内源性抗损伤机制，使机体对缺血、缺氧损伤发生主动性适应反应〔3,4〕。本研究旨在了解缺氧预处理能否对老年大鼠运动性骨骼肌损伤的发生有预防作用，并对其可能的机制进行初步探讨。

1材料与方法

1.1实验动物与模型60只(22±1)月龄雌性SPF 级SD大鼠，体重(523±38)g，6只4月龄雌性SPF 级SD大鼠，体重(318±24)g，购自四川大学华西医学中心实验动物中心，生产许可证编号：SCXK(川)2009-09；使用许可证编号：SYXK(川)2009-045，动物批号：20100801、20120203。4月龄为成年对照组(ADU组)，不进行任何处理。将(22±1)月龄大鼠按体重配对原则随机分为对照组(CON组)、大强度离心跑台运动组(EE组)、缺氧预处理+离心跑台运动组(HCP组)3组，每组20只。适应性喂养1 w后开始将HCP组进行缺氧预处理。根据氮气稀释空气的原理，借用体外循环麻醉中使用的空气/氧气混合仪，改装成空气/氮气混合仪，经Datex气体分析监护仪标定浓度，制成可快速地随意调节氧气浓度和气体流量的供气系统。调节空气/氮气混合器使氧浓度为10%。连续对HCP组大鼠进行7 d的缺氧预处理。具体的处理是每天用10%氧浓度处理大鼠30 min后以空气复氧5 min，连续处理5次。末次预处理后EE组和HCP组进行一次性大强度下坡跑台运动，速度19～21 m/min，坡度为-16，运动时间为90 min。运动中如大鼠不能坚持运动，取出休息2 min后继续，运动时间足90 min。

1.2骨骼肌的取材与处理分别于运动后24、48 h 2个时间点随机选取各组大鼠10只股静脉放血处死，离心管收集静脉血，将血样离心(4℃,3 000 r/min,10 min)分离血清，测定血清白细胞介素(IL)-6、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量；并迅速取右后肢比目鱼肌，于比目鱼肌中段切取部分肌肉组织，行多聚甲醛固定，用于制作石蜡切片，HE染色后观察肌纤维结构变化；取部分肌肉组织,快速称重，按重量/体积(g/ml)=1∶10加入冰冻生理盐水，制备匀浆，4℃低温离心机4 000 r/min离心10 min，取上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的检测。IL-6、CK、LDH、SOD、MDA的酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，采用Thermo Evolution 600紫外-可见分光光度计在450 nm波长比色。组织匀浆总蛋白浓度采用武汉博士德公司BCA蛋白定量试剂盒测定。

1.3统计学处理采用SPSS17.0软件行方差分析。

2结果

2.1大鼠骨骼肌HE染色观察结果对EE组和HCP组大鼠骨骼肌HE染色后进行光镜观察。EE组标本在运动后24 h出现炎症细胞浸润，出现肌膜模糊，局部肌丝变性，部分出现肌溶解。运动后48 h可见炎症细胞浸润严重，肌纤维明暗不清晰。HCP组运动后24 h、48 h均存在少量炎症细胞浸润，部分核聚集，横纹模糊。HE染色结果显示HCP组骨骼肌损伤情况较EE组减轻。

2.2各组大鼠血清IL-6、CK、LDH比较表1可见，在运动后两个时间点，HCP组IL-6水平均高于CON组而低于EE组(P<0.05)。与CON组相比，EE组和HCP组大鼠运动后各时间点CK、LDH水平升高，其中在运动后48 h差异尤为显著(P<0.01)。HCP组在运动后各时相血清CK、LDH浓度较EE组相比均有降低(P<0.05)。

2.3各组大鼠骨骼肌匀浆SOD、MDA水平比较在运动后24 h及48 h，HCP组MDA水平较CON组升高而较EE组降低(P<0.05)，EE组MDA水平在运动后各时相均高于CON组(P<0.05)。EE组肌肉组织SOD活性在运动后两个时间点均显著低于CON组和HCP组(P<0.05)，CON组和HCP组之间的SOD活性无显著差异(P>0.05)。见表2。

表1　各组大鼠血清IL-6、CK、LDH比较

与同时点CON组比较：1)P<0.01；与同时点EE组比较：2)P<0.05

表2　各组大鼠骨骼肌匀浆SOD、MDA水平比较

与同时点CON组比较：1)P<0.05；与同时点EE组比较：2)P<0.05；与同时点HCP组比较：3)P<0.05

3讨论

自由基代谢紊乱导致氧化应激失调是EIMD机制研究的一个热点。人体内的自由基以氧自由基为主，内源性抗氧化酶如SOD可清除氧自由基，从而保护细胞免受损伤。当机体受到异常刺激导致抗氧化体系能力减弱时，大量未及时清除的氧自由基可攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应,导致脂质过氧化物如MDA的产生。因此，SOD活性降低和MDA水平升高，可表明氧自由基的大量生成以及生物膜遭到破坏。研究发现正常情况下老年人骨骼肌SOD活性和MDA水平会随着年龄的增加而发生变化，导致机体抗氧化能力下降〔5〕，单纯运动和衰老都能使活性氧增多，引起氧化应激〔6〕，那么老年人运动势必会导致更为强烈的氧化应激。本研究结果说明老年大鼠骨骼肌损伤时机体抗氧化能力会进一步下降，而这可能是老年人容易发生运动性骨骼肌损伤且恢复较慢的原因之一。

前期的缺血/缺氧预处理可激发机体内源性抗氧化能力从而对随后到来的严重缺血、缺氧产生预防和保护作用。Saxena等〔7〕对大鼠采用氯化钴进行低氧处理研究发现缺氧预处理的骨骼肌运动能力和抗氧化损伤能力明显提升，同时也发现这种形式的低氧预处理能增强骨骼肌线粒体生成和有氧呼吸能力。本研究表明缺氧预处理能有效预防这种运动所致的骨骼肌损伤，前期的低氧刺激激发了机体防御系统，大大提高了其抗氧化能力，从而对抗离心运动导致的自由基增加所带来的损伤。MDA作为脂质过氧化的代表产物，是衡量机体自由基反应强度的敏感指标〔8〕。本研究说明低氧预刺激能够有效控制大强度离心运动造成的自由基增加，对生物膜存在保护作用从而减少肌纤维的损伤。

然而，本研究发现缺氧预处理并未完全阻止骨骼肌损伤的发生，提示氧化应激可能仅是EIMD产生的原因之一。有研究报道通过服用外源性抗氧化剂，能对运动性肌肉损伤产生一定的保护作用〔9～12〕，通过长期的有氧锻炼也能提高衰老大鼠骨骼肌的抗氧化能力〔13〕。因此,预处理与其他预防措施如按摩、药物、物理治疗等有无联合作用值得深入探讨，而低氧预处理是否在老年人体上对运动性骨骼肌损伤的发生具有同样的保护作用也有待于进一步研究。

综上所述,本研究显示，缺氧预处理可提高老年大鼠骨骼肌的抗氧化能力，对大强度下坡跑台运动所致的老年大鼠运动性骨骼肌损伤有预防作用。

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13金雯,李明学,钱海,等.有氧运动对衰老大鼠骨骼肌抗氧化能力的影响〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(14):2706-7.

〔2014-05-08修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

基金项目：国家体育总局重点研究领域项目(2014B014)；国家体育总局运动医学重点实验室资助项目(2013CTYY02)；四川省教育厅资助科研项目(12ZB014)；四川省高校科研创新团队专项基金资助项目(KYTD201011)

中图分类号〔〕R319；R873〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0005-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.002