食源性病原微生物检测与控制技术研究新进展

唐俊妮，汤 承(西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

【特约专稿】

食源性病原微生物检测与控制技术研究新进展

唐俊妮，汤 承
(西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

摘 要：最近在食源性病原微生物流行病学调查，检测手段以及致病因子控制方面出现了许多新的研究进展.特别是基因组序列以及基因组学和后基因组学工具的广泛应用，为病原微生物遗传学和生理学提供了丰富信息，也为病原微生物快速检测和控制研究提供了大量新手段.主要针对最近关于食源性病原微生物的检测和控制技术研究进展进行综述.目的是为食品安全管理以及食源性病原微生物控制策略提供技术支撑和带来一些新思考.

关键词：食源性病原微生物；快速检测技术；控制技术

随着食品工业的快速发展，食品安全管理、食品卫生及消费者习惯改变，以及气候和环境状况的影响，由病原微生物引起的疾病对公共卫生造成了严重威胁.食源性病原微生物通过污染的食物进入机体，而食物污染可以出现在食物链的任何一个环节.因此，无论是发展中国家还是发达国家食源性疾病时常暴发[1].我国由病原微生物引起的食物中毒疾病约占整个食物中毒事件的56.1%.近年来，我国针对病原微生物的监测取得了很大进步，2000年监测覆盖省份为32.3% (10/31)，覆盖城市为10.5% (35/334)，到2009年覆盖的省份已经达到71.0% (22/31)，覆盖的城市达到51.2% (171/334).2000年时我国只监测了单增李斯特氏菌，沙门氏菌和大肠杆菌O157: H7三种病原微生物，2009年已经增加到九种病原微生物，并且，每年检测的食物种类也在不断增加[2].由此可见，食源性病原微生物的监测与控制对于保障食品安全具有重要意义.

最近，在食源性病原微生物的流行病学调查、检测与控制技术上出现了许多新的研究进展.本文主要针对这些新进展进行综述，目的是为食源性病原微生物的检测和防控提供理论与技术支撑.

1　食源性病原微生物检测技术新进展

食源性病原微生物通过污染的食物传播疾病，因此，针对病原微生物的检测是食品标准规定的常规必检项目.目前用于不同食源性病原微生物的检测方法归纳起来可分为传统培养检测技术，分子检测技术以及免疫学检测技术等[3].

1.1 传统培养检测技术

传统培养检测技术主要是根据微生物生长繁殖特性，利用选择性培养基筛选和分离病原微生物，再结合形态学特征和生理生化特性对病原微生物进行鉴定.现行的国内和国际标准仍旧以传统培养检测方法为主.但是，为了加快检测过程，一些公司针对细菌的生化特性鉴定相继开发了一系列快速鉴定系统，如Micro-ID系统、Minitek系统和API系统等，能够结合传统的分离培养技术对病原微生物进行快速辅助诊断.以食物样品中分离检测单增李斯特氏菌为例，通常采用的富集培养基有BLEB(buffered Listeria enrichment broth)，FB(Fraser broth)以及UVM (University of Vermont Medium)等，而通常采用的分离鉴定平板为PALCAM和其它的显色培养基，关于单增李斯特氏菌检测的参考方法如GB 4789.30-2010，FDABAM，ISO 11290方法以及USDA-FSIS等通常采用培养检测或计数检测[4-5].传统的检测方法通常需要4 ～7天时间，检测过程繁琐，无法满足快速检测要求.另外，在传统培养检测过程中，人们逐渐意识到食品中需要检测的病原微生物种类在逐渐增多.通常只针对单一病原微生物进行富集培养.而目前面临的现实是同时要监测多种病原微生物.这样以来，检测过程繁琐，检测成本高，检测时间长.如果能针对多种待检病原微生物同时进行共增菌培养，将大大简化富集操作，这对于传统培养检测来说应该是非常重要的技术改进.国内外现有研究中，涉及到共增菌培养技术研究的文献主要包括沙门氏菌和志贺氏菌的共增技术[6]，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及沙门氏菌的共增技术[7]，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特杆菌的共增菌技术[8]，大肠杆菌、沙门氏菌及单增李斯特杆菌的共增菌技术[9]，副溶血弧菌、霍乱弧菌及沙门氏菌的共增菌技术[10]，以及笔者实验室研究的金黄色葡萄球菌、单增李斯特杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌O:157共增菌技术[11].这些研究满足了背景微生物复杂情形下对部分特定目标病原微生物进行共增菌的要求，为同时检测多种病原微生物的前期富集平台奠定基础.

1.2 分子检测技术

分子检测技术主要包括常规PCR技术，多重PCR技术，实时/定量PCR技术，环介导等温扩增技术(LAMP)，DNA微阵列技术，以及下一代测序技术等[1].这些技术具有快速，特异，敏感和节约时间以及劳动成本的特点而使用广泛.如Deekshit等[12]针对沙门氏菌SPI-2的两个毒力岛基因(ssaT、sseF)、沙门氏菌特异性基因(invA)、以及三个抗生素抗性基因(floR、sil1、tetG)设计了六对引物，建立了一种多重PCR检测方法.该方法不仅可直接检测食品中的沙门氏菌，还能对沙门氏菌的耐药基因进行调查.王娉等[13]利用金黄色葡萄球菌nuc基因、耐甲氧西林mecA基因和四种传统肠毒素基因(sea、sec、sed、see)建立了六重PCR检测体系，成功应用于牛奶、肉馅和牛肉样品中金黄色葡萄球菌检测.笔者实验室针对金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和福氏志贺氏菌五种食源性病原微生物建立了一种多重PCR方法.分别针对金黄色葡萄球菌的16S rDNA基因、单增李斯特氏菌的hlyA基因、沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157:H7的eaeA基因和福氏志贺菌的ipaH基因设计五对特异性引物，该方法对金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、肠炎沙门菌、大肠杆菌O157:H7、福氏志贺菌的检出限分别为6.4、800、32、32和160 pg基因组DNA.该方法为食品中五种常见病原微生物快速检测奠定基础[14-15].Yang 等[16]利用免疫磁性分离技术与多重PCR技术开发了一种能同时检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法，可直接用于生菜、番茄和牛肉样品中，该技术沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌的最低检测限分别为5.1×103CFU/ g、7.5×103CFU/ ml和8.4×103CFU/ ml.Villamizar-Rodríguez等[17]建立了一种能同时检测单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌等九种常见食源性病原微生物的多重PCR检测法，该方法包括了细菌预增菌步骤和毛细管电泳，可直接用于肉类、乳制品、罐头鱼、糕点产品等食物样品检测.另外，目前应用较广的实时荧光定量PCR技术是通过在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积进行实时监测反应进程.与常规的PCR相比，实时荧光定量PCR能够对DNA模板进行定量检测，特异性更强，灵敏度更高，还可减少扩增产物的交叉污染.Cremonesi等[18]利用TaqMan荧光探针建立实时PCR对阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等二十种常见食源性病原微生物进行检测，灵敏度达1pg基因组DNA，相当于1cfu/ mL.Niu等[19]建立了基于熔解曲线分析的双管通路多重实时PCR(MCMRT-PCR)能同时检测六种食源性病原微生物(大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、副溶血型弧菌)，该方法用在牛奶样品中的灵敏度可达105CFU/ mL.基于PCR技术的广泛使用，一些仪器公司也在大力开发便携式的PCR仪，例如Pockit?公司开发的现场便携式实时荧光PCR仪，将PCR系统和电泳系统合二为一，最快能在60 min完成检测.由于其体积小、重量轻、灵活性强能较好适应特殊地区样品快速检测.但是，便携式设备也摆脱不了提取样品核酸的复杂过程，来自不同样品的核酸快速提取和保存是目前分子检测需要突破的关键技术.笔者实验室探索的利用微波加热原理快速提取细菌DNA技术可用于常规PCR检测，该方法具有广泛的适用性，提取的DNA能满足食源性病原微生物的常规PCR检测需求，为微生物分子检测中DNA模板的获取提供了快速手段[20].

另一个环介导等温扩增技术(LAMP)由日本学者Notomi在2000年提出的一种新型基因诊断技术，该技术是利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，以及四条能够识别靶序列上六个特异区域的引物，在等温条件下(63℃)对核酸进行扩增，最后通过观察白色浑浊对检测结果进行判断[21].LAMP技术不需要特殊的仪器，肉眼就可观察结果.宋涛平[22]利用金黄色葡萄球菌nuc基因的六条引物建立了可视化的LAMP检测法，检测灵敏度达0.001 ng/μL.胡惠秩[23]等利用荧光染料PMA与LAMP技术结合建立了一种能直接检测灭菌牛乳中金黄色葡萄球菌的方法，该方法不仅灵敏度高(3.2 CFU/ mL)，还能对体系中死/活菌进行区分.Oh[24]等结合铬黑T(EBT)比色法建立一种用肉眼观察结果的LAMP检测系统，可用于大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和副溶血性弧菌的检测.Wang 等[25]比较了内部实时LAMP系统与商品化的LAMP系统，发现商品化LAMP系统无假阳性结果，而内部实时LAMP系统假阳性结果较为严重.可见，LAMP系统假阳性问题是目前急需解决的关键问题.

分子杂交技术和基因芯片技术也已广泛应用于食源性病原微生物的检测中.Wu[26]利用量子点标记DNA探针构建了一种大肠杆菌的荧光原位杂交检测法，首次实现了荧光原位杂交技术对大肠杆菌的检测.Almeida等[27]利用肽核酸探针建立一种沙门氏菌的荧光原位杂交检测法.该方法直接对血液、粪便以及婴儿奶粉样品进行检测，准确度和特异性高达100%.Zadernowska等[28]将酶联免疫荧光法、ISO传统沙门氏菌检测法以及荧光原位杂交法用于牛肉、猪肉、禽肉样品中沙门氏菌检测并进行方法的比较，发现荧光原位杂交法特异性最强，敏感度较高，更适用于肉类样品中沙门氏菌快速检测.基因芯片技术将探针分子固定于芯片表面，并与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号强度获取样品分子信息，从而鉴定细菌种类[29].Guo等[30]利用沙门氏菌O抗原开发了一块能鉴定沙门氏菌46种血清型的高通量基因芯片，灵敏度可达到50 ng基因组DNA.Gomes等[31]在DNA芯片中植入16个由147个碱基组成的探针，可对水中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌等病原微生物进行监测.高兴等[32]利用Oligo 6.0和Clustal X软件设计探针并制备基因芯片，用于痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和肉毒梭菌等九种食源性病原微生物的检测，基因组DNA检测灵敏度约为102～103pg/μl，芯片重复性变异系数(CV)值＜15%.但是，基因芯片高成本是限制该方法发展的一大难题，若想将基因芯片技术广泛应用于食源性病原微生物的检测，还须解决简化样品制备、简化标记操作等技术核心.

1.3 免疫学检测技术

免疫学检测技术以病原微生物作为免疫原，制备相应的特异性抗体，通过抗原抗体特异性结合进行检测.免疫学方法因操作简便、快速成为目前研究的主流方向.近些年，关于酶联免疫吸附法检测食源性病原微生物的报道较多.如Brooks等[33]建立的双抗夹心ELISA可以对不同血清型沙门氏菌进行检测，方法敏感性为99.9%，诊断特异性为99.6%.Park等[34]建立双抗夹心ELISA方法检测阪崎杆菌，特异性较好，在婴儿配方奶粉中检测限达6.3×104cfu/ mL.Tu 等[35]利用重链可变区抗体和单克隆抗体建立的夹心ELISA方法能检测巴氏杀菌奶中的单增李斯特氏菌，最低检出限为1×104cfu/ mL.Galikowska等[36]利用噬菌体代替抗体建立ELISA法可用于沙门氏菌和大肠杆菌的检测，其检测灵敏度为106cfu/ mL.笔者实验室也建立了快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEI 和SEM的双抗夹心酶联免疫方法，能够定性和定量检测新型肠毒素SEI和SEM，具有检测准确度高等优点[37-38].目前，酶联免疫法作为检测食源性病原微生物的首选广泛应用于科研和检测机构，但是存在的问题是试剂盒的稳定性需要突破.

另一种免疫荧光法是以荧光素标记的抗体来实现对食源性病原微生物的检测，该方法由于靠标记物本身发光，和普通有色物质的光吸收相比具有更高的灵敏度.最常用的荧光标记素主要有免疫荧光微球和量子点.McLauchlin等[39]建立间接免疫荧光方法可直接检测奶酪中的单增李斯特氏菌.Wen等[40]利用免疫磁球微球和免疫荧光微球结合沙门氏菌，可直接在荧光显微镜下检测夹心免疫复合物，并用荧光光谱仪进行定量，该方法在105～107cfu/ mL线性范围效果良好，最低检测限达10 cfu/ mL.张赛等[41]利用免疫磁珠与荧光免疫层析技术相结合直接用于单增李斯特氏菌检测，其特异性强，人工污染样本最低检测限为1×104cfu/ mL.量子点因其荧光强度强、稳定性好、量子效率高、生物相容性好、波长可控等因素逐渐代替传统有机荧光染料.量子点标记抗体后可作为特异性免疫荧光探针，通过与病原微生物结合复合物的荧光强度来检测实现病原微生物的定量检测[42].Wang等[43]利用量子点标记的抗体与免疫磁珠共同作用检测大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌，该方法在人工污染的牛肉中最低检测限达10 cfu/ mL.Krizkova 等[44]利用量子点与免疫磁珠开发了一种便携式小型仪器，能快速检测样品中的金黄色葡萄球菌.法国梅里埃公司利用酶联荧光测定技术(ELFA)开发一种能检测多种食源性病原微生物的自动免疫分析仪(VIDAS)，该分析仪摆脱传统酶联反应复杂的工序，大大缩短了检测时间，且操作简单，可避免加叉污染，也可避免人为操作带来的误差.该公司进一步开发一种袖珍型VIDAS检测仪器，便于携带，能较好应用于偏远地区食源性病原微生物的检测.

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标记物，联合免疫层析技术进行病原微生物的检测.现阶段主要是利用胶体金开发快速检测产品.如刘菁等[45]利用醋酸纤维薄膜作为吸附介质联合胶体金技术开发一种直接检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7试纸条.张国祖等[46]利用含金黄色葡萄球菌isdB蛋白单克隆抗体垫和金标抗体垫开发一种检测金黄色葡萄球菌的检测试纸卡，该试纸卡特异性强、准确度高，不仅能直接检测食品污染样本，还能用于畜禽的快速诊断.胶体金试纸条检测不需要特殊仪器及复杂的操作，使用方便，易于掌握，检测成本低.因此，对于检测单一病原微生物而言免疫胶体金技术具有部分优势.1.4 生物传感器

生物传感器是将酶、抗体、抗原、核酸、细胞、微生物以及组织等生物活性物质作为识别材料，与氧电极、场效应管、光敏管、压电晶体等理化换能器以及信号放大装置构成的一种分析系统，它能将对生物物质敏感程度转换为电信号从而对病原微生物进行检查.具有检验量少，分析速度快等优点.Abdalhai等[47]开发了电化学核酸基因组生物传感器可对新鲜牛肉中的金黄色葡萄球菌进行检测，其在牛肉样品中的检测限达1.23 ng/ mL.Song等[48]利用荧光共振能量转移以及碳纳米粒子结合分子杂交技术开发了一种检测肠炎沙门氏菌的生物传感器，其在牛奶样品中的线性范围为1.5×102～3×103CFU/ mL.Masdor等[49]利用抗空肠弯曲菌多克隆抗体、单克隆抗体，以及金纳米粒子组建了基于石英晶体平台的免疫传感器，其能特异性的捕获样品中的空肠弯曲菌，从而减少预富集步骤，该方法的检测限为150 CFU/ mL.Xiao等[50]将DNA探针共价固定于光纤生物传感器内，再利用荧光DNA分子杂交技术研制了一种便携式光纤倏逝波传感器，该传感器表面可用0.5%十二烷基硫酸钠进行再生，灵敏度高、特异性强，可代替实时PCR实现志贺氏菌快速检测.Cho等[51]利用免疫磁珠与目标菌形成的“三明治”复合体和利用蛋白酶K消化释放荧光的探针技术研制了一种可用于多种食源性致病菌检测的原位荧光免疫传感器，其在菠菜、鸡肉、牛奶样品中最低检测限达5 CFU/ mL.目前关于生物传感器的研究大多只限于实验室，因其成本高目前还没有办法产业化，真正要实现生物传感器技术检测的多元化和大众化还有很长的路要走.

2　食源性病原微生物控制技术新进展

上述的食源性病原微生物检测技术新进展大大推进了病原微生物的流行病学调查和监测范围，为食源性病原微生物的监管带来了技术突破.针对食品微生物控制技术的研究也很重要，常见微生物控制技术有低温，气调，加热杀菌，非加热杀菌，干燥脱水、以及化学与生物活性成分杀菌等.本文主要针对其中的非加热杀菌和生物活性成分杀菌进行综述.非热杀菌技术主要涉及超高压均质化技术、微波、脉冲电场、超声波以及辐照杀菌技术等[52].生物活性成分杀菌研究主要侧重于植物提取物和细菌素.

2.1 非热杀菌技术

2.1.1 超高压均质化技术

超高压均质化技术(Ultra High-Pressure Homogenization，UHPH)作为一种连续的冷杀菌技术，是利用超高压产生的对液体食品挤压以及压力释放时通过高速撞击和强烈剪切等方式来处理食品，使微生物的细胞结构发生破坏和改变，从而失去或钝化微生物活性达到杀菌目的[53].Amador-Espejo等[54]研究发现UHPH条件为300Mpa，入口温度Ti =85℃时，能够使(～106CFU/ mL)的蜡样芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，热脂肪芽孢杆菌，耐热芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌完全失活，并且发现嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对超高压均质耐受性较其它几种微生物强.他们随后又研究UHPH对牛奶的灭菌效果，发现当UHPH处理条件为300 Mpa，入口温度Ti =75和85℃时，处理后的牛奶在30和45℃条件下培养没有微生物生长，与超高温瞬时处理(UHT)乳相比较，UHPH处理乳的色泽，乳颗粒大小，粘度，缓冲能力，酒精稳定性以及蛋白质水解能力相当或更好一些，并且感官评定蒸煮味降低了[55].Dong等[56]研究发现当UHPH压力条件为200，300，350 MPa入口温度Ti约 80℃处理，对初始接菌量为6 log10cfu / ml的磷酸盐缓冲液PBS(0.01 M，pH 7.0)和低脂牛奶(1.5%，pH 6.7)以及全脂牛奶(3.5%，pH 6.7)中的芽孢失活率进行比较，发现脂肪的存在并没有对芽孢提供明显保护作用.Hang等[57]在压力为300 Mpa条件下20℃对副溶血性弧菌处理10min，计数未检出活细胞.处理后的细胞显微结构发生改变，细胞壁皱缩，细胞质外泄，细胞内出现大量电子传输区域，细胞膜消失，核酸物质以及蛋白质聚集凝结，同时细胞膜蛋白受损，细胞膜通透性增加，造成细胞液外渗.陆海霞等[58]研究单核增李斯特氏菌在压力为300，350，以及400 Mpa时，25℃处理15 min.细菌数目从9 Log CFU分别降到5.20，3.27和1.35 Log CFU，压力为450 Mpa时没有活菌存在.透射电子显微镜检测发现细胞膜和细胞壁都被破坏了，细胞质聚集，出现大量的电子传输区域.Valencia-Flores等[59]研究UHPH对含卵磷脂的杏仁饮料(AML)和不含卵磷脂的杏仁饮料(AM)的微生物、物理性质(分散稳定性、粒径分布和疏水性)、化学性质(氢化物指数)等相关参数影响的研究发现UHPH压力和入口温度的组合对微生物具有显著的致死效果.大多数UHPH处理的杏仁饮料的质量比巴氏杀菌样品高，且当压力为300 Mpa，入口温度为65和75℃时，处理时间小于0.7 s后得到的样品，培养没有细菌生长.UHPH处理的杏仁饮料颗粒尺寸明显地减小，物理性质比一般热处理稳定.Balamurugan等[60]研究三种不同盐(NaCl、KCl、CaCl2)浓度对鸡肉品质以及所含单增李斯特氏菌的灭活作用.结果表明压力600Mpa时，盐种类、浓度和压力处理时间对单增李斯特氏菌有显著影响.高压处理对于提高微生物安全性，减少家禽产品中的钠盐添加量是一种可行方法.超高压均质杀菌技术的研究可以使传统食品加工方式发生革命性变化.

2.1.2 微波杀菌技术

微波杀菌是另一种非热杀菌技术.Bhasin等[61]采用微波650W作用5 min可以使白色念珠菌和铜绿假单胞菌完全消除，7 min可以完全消除金黄色葡萄球菌.Liu等[62]研究纳米ZnO和微波加热灭菌对真空包装中国菜心质量的影响.发现在真空包装菜心中添加0.01～0.02 g/ kg的ZnO纳米颗粒悬浮液可以减少细菌菌落数.随着ZnO纳米颗粒量的增加，抗菌活性增强.利用微波加热(915和2450 MHz)对菜心进行加热灭菌，样品具有良好的产品质量，且微波处理条件为400 W，150 s(2450 MHz)时，总菌落数最低.他们认为最好的杀菌条件为微波加热(400 W，150 s，2450 MHz)联合0.02g/ kg的ZnO纳米粒子，在这种处理条件下菜心样品在厨房7天细菌总数仍＜1 log CFU/ g.微波技术已经广泛应用在食品工业中的杀菌方面.但也存在一些问题.如微波杀菌中的非热效应机理以及如何量化问题.目前还缺乏快速有效的温度探测和控制系统.还有就是微波杀菌技术工业化设备成本相当高，影响了其使用的广度.

2.1.3 高压脉冲电场杀菌技术

高压脉冲电场杀菌技术是采用高压脉冲杀灭微生物的一种新技术.Mosqueda-Melgar等[63]研究脉冲电场对大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、单增李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等病原微生物的灭活作用.脉冲电场处理液态食品表明能有效消灭李斯特氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7等，达到巴杀灭菌的水平.但是这种杀菌方式也有局限性，脉冲电场对于液体食品中的蜡样芽孢杆菌，空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌等的杀灭效果不佳.Gurtler等[64]研究了脉冲电场对橙汁中大肠杆菌O157:H7;鼠伤寒沙门氏菌以及20株非致病性细菌的灭活效果.发现在相同条件下，肠出血性大肠杆菌O157:H7的失活率略高于非致病性大肠杆菌.55℃处理时，肠出血性大肠杆菌O157:H7比非致病性大肠杆菌对脉冲电场更敏感.这为研究杀灭大肠杆菌O157:H7提供一个理想的范围.与传统的加热杀菌相比，脉冲场杀菌具有处理能耗低，时间短，升温小，对环境和人类安全等优点.以后应加大对该技术应用的深度和广度研究.

2.1.4 超声波杀菌技术

超声波杀菌是将要杀菌的食品放在传送装置中匀速通过超声波换能器实现杀菌过程自动化，主要用于牛奶、果汁、酱油、饮用水、水果罐头以及酒类等液体食品的杀菌.Ayyildiz等[65]研究超声(US)和二氧化氯(ClO2)联合协同作用提高了废水中大肠杆菌E-.coli和总大肠菌群的灭活效率.Baumann等[66]研究超声和臭氧单独使用以及联合使用时对去除不锈钢片表面单增李斯特氏菌生物被膜的影响.结果表明功率超声和臭氧氧化组合可能是一种处理不锈钢食品接触表面细菌生物被膜的有效方法.Sesal等[67]研究频率为30 kHz、功率为100 W超声对生理盐水中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭活作用.大肠杆菌在超声处理条件下死亡率显著增加，与预期相反，金黄色葡萄球菌的数目反而增加了.说明超声波辐照对于金黄色葡萄球菌的消除作用不显著.Zhang等[68]研究高铁酸钾，超声以及高铁酸钾结合超声技术[Fe(VI)-US]对磺胺类抗生素的降解机制.结果显示pH值和高铁酸钾剂量是影响抗生素降解效果最主要因素.Jiang 等[69]比较热、微波、超声波处理三种不同灭菌方法，对黑桑椹汁存储期间主要生物活性以及抗氧化活性的影响.发现热处理过的果汁抗氧化活性被耗尽;超声灭菌的果汁在贮藏期间相比微波和热处理的果汁表现出较高的总酚，花色素苷和抗氧化活性.尽管超声波杀菌具有速度快，对样品和人无伤害等优点，但也存在消毒不彻底的问题.另外，超声波杀菌一般只适用于液体样品，并且处理量不能太大.以后应加大评价超声波灭菌过程中对食品品质影响以及超声波和其他处理方法联用时的协同灭菌机理研究.

2.1.5 辐照杀菌技术

尽管传统加热处理仍旧在食品工业中占主导地位，但非加热食品处理技术如辐照杀菌的应用也较为广泛，该技术是利用射线的穿透性杀死或抑制微生物的某些生理活动，起到延长贮藏和保鲜时间的作用.该技术里面的一种是利用短波长的紫外辐照(UVC)，UV-C具有很多好处，能够杀灭宽广范围果汁中的病原微生物和腐败微生物，减少营养损失和感官质量.UV-C不会产生化学残留或有毒化合物.UV-C的杀菌特性依赖于DNA吸收UV光，诱导DNA分子结构扭曲，抑制转录和复制，最终导致细胞的死亡.Gouma等[70]建立了采用UV-C光照和UV-H微热处理用来灭活接种在鸡汤里的常见食源性病原微生物大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，单增李斯特氏菌以及金黄色葡萄球菌的处理标准.Aihara等[71]采用紫外线发光二极管(UVA-LED)辐照接种有大肠杆菌DH5α的蔬菜组织.将蔬菜组织均质化并进行细菌菌落计数.UVALED对蔬菜组织的影响进行检测.结果表明辐照处理90 min后，细菌数目减少了3.23 log.存活下来的细菌对比未经辐照的细菌生长缓慢.说明UVA-LED在蔬菜生产加工行业的表面杀菌具有潜在应用价值.目前关于辐照技术在杀菌保鲜中的应用已经取得了良好进展，但值得注意的是某些病原微生物在辐照后的贮藏时间里仍然会复活，另外，辐照杀菌过程中所产生的辐照味、脂肪氧化和风味损失等影响也应给予重视.

2.1.6 其它杀菌技术

Hertwig等[72]利用冷源等离子体对胡椒粉中的沙门氏菌、枯草芽胞杆菌孢子以及萎缩芽胞杆菌胞子处理30 min，结果显示细菌数目分别降低了4.1 log CFU / g，2.4 log CFU / g和2.8 log CFU / g，同时对产品的色泽风味等无显著影响.Loraine等[73]研究空化射流技术对革兰氏阴性的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌以及革兰阳性丁香假单胞菌，铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的灭菌效果.结果显示空化射流技术对革兰阴性菌灭菌效果强于革兰氏阳性菌.但在相同的条件下，对不同革兰氏阴性菌的作用也存在显著性差异.

2.2 生物活性成分杀菌研究

2.2.1 植物提取物抑菌杀菌效果

植物提取物因含有多种抑菌杀菌生物活性成分而广泛用于病原微生物的研究.如Rakholiya等[74]对苦瓜的四个部分(茎叶，果皮、果肉和种子)进行提取，研究提取物对5株革兰氏阳性菌株，6株革兰氏阴性菌株和4株真菌的抑菌效果.他们的结果认为革兰阴性杆菌对提取物比革兰氏阳性菌或真菌菌株更敏感.苦瓜提取物可用于食品中假单胞菌属的控制.Monu 等[75]研究了白芥子挥发油提取物对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、单增李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌等的抗菌活性，以及食品成分对抗菌活性影响.检测的微生物在白芥子挥发油浓度为8.3 g/ L时生长被抑制.白芥子挥发油对革兰氏阴性菌抑菌活性更强，其中，肠炎沙门氏菌最敏感，2.1 g/ L就会受到抑制.大豆油使白芥子挥发油对单增李斯特氏菌抑菌活性降低，同样，与5%大豆油作用48 h，白芥子挥发油对肠炎沙门氏菌失去抗菌活性.与1%酪蛋白酸钠作用后，白芥子挥发油对肠炎沙门氏菌失去抗菌效果，并且对单增李斯特氏菌的抑菌效果降低.但加入淀粉，白芥子挥发油对单增李斯特氏菌和肠炎沙门氏菌的抗菌活性无显著影响.Pagliarulo等[76]采用50%(v/ v)的乙醇水溶液提取石榴和果皮中的多酚物质，用琼脂扩散法检测其对临床分离的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌活性.石榴提取物具有明显的抗菌活性.特别是果汁粗提取物在浓度为20mg时对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌形成明显的抑菌圈.果皮粗提取物也表现出较高的抗菌活性.Li等[77]也探讨了石榴皮单宁对单增李斯特氏菌抗菌活性及其作用机制.石榴皮单宁对不同单增李斯特氏菌株的最小抑菌浓度为1.25-5.0mg/ mL.石榴皮单宁可明显降低单增李斯特氏菌株细胞内的ATP浓度，增加细胞外钾和ATP浓度，以及引起细胞成分释放.电子显微镜观察表明单增李斯特氏菌细胞膜结构明显受损.他们得出石榴皮单宁能够破坏单增李斯特氏菌细胞膜的完整性，导致细胞失活.认为石榴皮单宁可作为食品防腐剂用来控制食品中李斯特菌污染和减少李斯特菌病的潜在风险.Shimamura等[78]探究了一种茶提取物可降低由金黄色葡萄球菌肠毒素SEA引起疾病的风险.他们利用实时RT-PCR发现茶提取物明显抑制了金黄色葡萄球菌肠毒素sea基因的转录，表明茶提取物可以抑制肠毒素SEA的产生.笔者实验室也研究了不同食品添加剂对金黄色葡萄球菌肠毒素基因转录的影响，发现不同添加剂抑制活性差异比较显著，茶多酚的效果比较明显(该数据待发表).Abbassi 等[79]研究了一种欧洲和地中海盆地南部土著植物喷瓜的酚含量以及其对食源性病原微生物的抗菌活性.喷瓜的不同植物器官中总多酚含量不同，叶片和果实中酚含量比根部高6倍.0.004-2.5mg/ ml浓度时观察到对食品病原微生物有抑菌活性，他们认为喷瓜提取物可以作为食品和制药行业的防腐剂.Singab等[80]研究了蓝花楹精油的抗菌活性，在MIC值分别为2.2 和2.9mg/ ml时，精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑菌活性，并对白色念珠菌，鼠伤寒沙门氏菌和志贺氏菌也具有一定的抑制活性.Fournomiti 等[81]对牛至，鼠尾草和百里香精油在不同条件下的抗菌活性进行研究.对临床分离的27株多重耐药大肠杆菌，7株产酸克雷伯氏菌，以及16株肺炎克雷伯菌采用微量肉汤稀释法测定其抗菌活性.研究表明产酸克雷伯菌最敏感，其次是肺炎克雷伯菌，大肠杆菌是对精油抑菌作用不敏感.三种精油中，百里香精油效果最佳.Ozogul等[82]采用纸片扩散法探究了11种精油(松树油、桉树、百里香、鼠尾草茶、薰衣草、橙、月桂、柠檬、桃金娘、迷迭香、杜松)对食源性病原微生物(大肠杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌)的抗菌活性.精油提取的主要成分为单萜烃、α-蒎烯、柠檬烯、单萜酚、香芹酚和含氧萜、樟脑、桉叶素、桉叶素、芳樟醇、乙酸芳樟酯.虽然所测试的精油抗菌效果取决于精油化学成分变化和微生物种类，但大多数精油对一个或多个菌株都具有抗菌活性.笔者实验室也探讨两种不同颜色(紫皮洋葱和白皮洋葱)的生洋葱汁对五种常见食源性病原微生物的抑菌效果.GC-MS表明洋葱汁的主要挥发性成分是含硫化合物.不同品种的洋葱原汁对五种常见食源性病原微生物(金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌)均具有一定的抑菌效果，抑菌效果强弱与洋葱汁浓度呈正相关，紫色洋葱汁的抑菌效果更好[83].在此基础上，我们又研究了柠檬鲜榨汁对7种常见食源性病原微生物(金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、肠炎沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、福氏志贺菌以及肠出血性大肠杆菌)的抑菌效果以及对细菌生物被膜形成影响.柠檬果皮和果肉主要挥发性成分以柠檬烯，γ-萜品烯，柠檬醛等为主.柠檬果肉鲜榨汁对七种常见食源性病原微生物均具有明显抑菌效果，而果皮鲜榨汁均未出现明显抑菌作用[84].这些研究为植物提取物作为食品添加剂的应用奠定了基础.但同时也存在一些问题，比如成本问题，尽管天然植物资源十分丰富，但许多植物资源价格贵且有限，规模化生产需要大量原料，仅靠天然采集很难满足市场需求.另一个需要关注的问题是提取活性成分的稳定性，不同品种和来源的植物，其活性成分差异显著，因此，如何使提取工艺标准化和明确活性物质是关键.

2.2.2 细菌素抑菌杀菌效果

细菌素是微生物在代谢过程中产生的一类具有抑菌活性的蛋白质或多肽类物质.因其不会产生耐药性，广泛用于病原微生物的抑菌杀菌研究中.如Wang 等[85]研究了细菌素Thurincin H的抗菌活性及其机制.Thurincin H是由苏云金芽孢杆菌SF361产生的细菌素.它对大多数革兰氏阳性食源性病原微生物及腐败微生物(如单增李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等)具有抑制活性.其疏水性和结构与现有的细菌素完全不同，蜡样芽孢杆菌经低浓度Thurincin H处理后，通过扫描电子显微镜成像发现细菌仍然呈现常规杆状细胞形态，在高浓度Thurincin H处理后细胞才失去完整性.但这两种浓度都可导致细胞的存活率降低99%以上.相反，乳酸链球菌素在浓度低时可引起显著的细胞膜通透性变化.这些结果表明Thurincin H与乳酸链球菌素具有不同的抑菌作用机制.产志贺毒素大肠杆菌(STEC)是一个重要的人畜共患食源性病原，益生菌可以减少该菌感染的严重程度.Rigobelo EE等[86]对携带stx1，stx2和eae基因的非O157的STEC菌株感染进行研究，采用绵羊作为模式动物，利用益生菌(嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳杆菌、粪肠球菌和嗜热链球菌)混合物进行治疗.在实验观察的第三，第五和第六周，每日接受混合益生菌治疗的绵羊粪便中非O157的STEC数量跟未治疗动物相比明显降低.混合益生菌降低了羊粪便中的STEC，从而减小了传染给人类的机率.植物乳杆菌也已被证明具有增强肠上皮屏障功能，可以调节宿主的免疫反应，如Eom等[87]通过刺激宿主肠道上皮细胞的免疫反应，研究植物乳杆菌JSA22菌株对鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌诱导的细胞毒性影响.表明植物乳杆菌JSA22具有益生特性，并能抑制肠上皮细胞鼠伤寒沙门氏菌感染.在抗生素耐药性成为严重公共卫生问题的时代，植物乳杆菌的抗菌活性将有着广泛的应用价值.这里面如何准确筛选原核生物中抗菌药物的生产方法也非常重要.Dubourg等[88]通过扩散法测试八株乳杆菌对临床分离的十二株常见病原微生物有明显的抑菌圈.其中植物乳杆菌CIP 106786和鼠李糖乳杆菌CSUR P567具有广泛的抗菌活性，而嗜酸乳杆菌DSM 20079相对不活跃.Cavicchioli等[89]证实了山羊乳中乳酸菌抗单增李斯特氏菌活性，这些乳酸菌株经脉冲场凝胶电泳分型表现出较高的遗传多样性.Murdock等[90]对乳链菌肽和乳铁蛋白抑制单增李斯特氏菌和大肠杆菌O157:H7生长是否具有协同作用进行研究.他们将乳铁蛋白和乳链菌肽单独或共同接入蛋白胨酵母葡萄糖肉汤中，再接种单增李斯特氏菌或大肠杆菌O157: H7，然后测定乳链菌肽和乳铁蛋白对病原菌生长的抑制作用.发现1000 μg / ml的乳铁蛋白能有效抑制单增李斯特氏菌.然而对大肠杆菌O157:H7抑菌效果不明显.乳铁蛋白和乳链菌肽协同作用能有效抑制单增李斯特氏菌和大肠杆菌O157:H7生长，500μg / ml乳铁蛋白和250 IU / ml乳酸链球菌素结合使用能有效抑制大肠杆菌O157:H7生长，而250μg / ml乳铁蛋白和10 IU / ml乳酸链球菌素就可抑制单增李斯特氏菌生长.Grande Burgos等[91]对肠球菌产生的细菌素Enterocin AS-48的抗菌活性进行研究.细菌素Enterocin AS-48构象排列形成五个α-螺旋和一个紧凑的球状结构，含有70个氨基酸残基由肽键首尾相连.这种阳离子肽可以插入到细菌细胞膜上，导致细胞膜通透性增加，最终导致细胞死亡.Enterocin AS-48已被证实对食源性病原微生物(沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽孢杆菌)和腐败微生物(耐热菌，芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、嗜热脂肪芽孢杆菌、肉葡萄球菌以及清酒乳杆菌等)都具有抗菌活性.Enterocin AS-48结合精油，酚类化合物，物理化学处理，如高压脉冲电场等可增加抗菌效果.这些研究为细菌素的应用奠定了很好的基础.尽管对于细菌素的研究目前取得了很大进步，但是成功进行商品化的细菌素还为数不多.借助于基因组学，分子生物学和基因工程的新技术有助于将来发现和开发更多的细菌素产品.

3　展望

上述关于食源性病原微生物检测和控制技术的研究进展对于未来食源性病原微生物的流行病学调查，检测以及控制都具有很好的借鉴意义.新的知识也发现病原微生物不仅能够改变和适应不同环境条件，这些病原微生物自身还能够建立适应环境的网络响应机制帮助它们在宽广的条件下存活，甚至刺激它们携带毒力的潜力.分子基因组学和后基因组学工具的广泛应用将来可以进一步揭示食源性病原微生物在食物相关环境中的行为，为食源性病原微生物的监测研究以及食物链的传播提供新线索.新的基因组序列提供了对微生物遗传学和生理学的丰富信息，为建立新的检测技术和鉴定食源性病原微生物提供更多新策略.所有这些为病原微生物的防控奠定了基础.另一方面，对食源性病原微生物代谢组学的研究也可为寻找到新的检测靶标和建立基于代谢组学方法的鉴别技术带来新思路.

未来的研究应该着重于建立更加完善的食源性病原微生物及其致病因子监测及溯源体系;揭示食源性病原微生物在食品生产链中的流行和传播规律;找到更加理想的病原微生物综合防控技术，为有效控制影响食品安全的食源性病原微生物提供理论与技术支撑.

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(责任编辑：李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑：周序林，郑玉才)

New progress in research on detection and control of foodborne microbial pathogens

TANG Jun-ni，TANG Cheng
(School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

Abstract:There is some recent research progress in the epidemiology，detection，and control of foodborne microbial pathogens.Especially，the growing availability of genome sequences，and the extensive application of genomics and postgenomics tools provide some useful information for bacterial genetics and physiology，and also provide new strategies for foodborne pathogens detection and control.This paper reviews the most recent research on foodborne microbial pathogens detection and control technology，which provides theoretical and technical guidance and brings new thoughts to food safety management and major foodborne pathogens prevention and control.

Key words:foodborne pathogens;rapid detection;control

中图分类号：R155.5；TS201.3

文献标志码：A

文章编号：2095-4271(2016)02-0139-12

doi:10.11920/ xnmdzk.2016.02.004

收稿日期：2015-12-28

作者简介：唐俊妮(1971-)，女，汉族，湖北枣阳人，教授，博士，研究方向:食品安全与食品微生物.E-mail:junneytang@ aliyun.com

基金项目：国家自然科学基金(31371781);2014年度教育部回国留学启动项目