响应面优化微波辅助酶法提取柚皮多糖工艺

李 静,邓青云,刘爱璐,黄 文,*

(1.华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070;2.湖北工程学院生命科学技术学院,湖北孝感 432000)

响应面优化微波辅助酶法提取柚皮多糖工艺

李 静1,2,邓青云2,刘爱璐1,黄 文1,*

(1.华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070;2.湖北工程学院生命科学技术学院,湖北孝感 432000)

以柚皮为原料,利用微波辅助酶法提取柚皮多糖。在单因素实验的基础上,选取纤维素酶与果胶酶加酶比、微波时间、微波功率为自变量,柚皮多糖得率为响应值,通过响应面实验优化提取工艺。结果表明:柚皮多糖提取的最佳工艺条件为酶解时间30 min,纤维素酶与果胶酶比例为1.3∶1,pH为3,加酶量2%,酶解温度50 ℃,料液比1∶40,微波时间2.5 min,微波功率720 W。在此条件下,经验证柚皮粗多糖的实际得率可以达到22.8%。

柚皮,多糖,提取工艺,微波辅助酶法

柚子是芸香科植物的成熟果实,我国作为柚子的主产地,柚类种植面积和产量都居世界前列[1]。柚皮占整个柚子的43%～48%,除含有水分、维生素、矿物质这些人体必需的营养素外,还含有多种对人体健康有益的生理活性成分[2-4]。柚皮多糖作为植物多糖的一种与其他的植物多糖类似。不仅含有重要的功效成分,而且具有多种生理功能,其应用的范围也在逐步扩大[5-7]。每年柚子成熟后,大量柚皮成为垃圾,不仅污染环境而且造成资源浪费。关于柚皮多糖的提取还停留在传统的提取方法阶段,如热水浸提、回流提取等[5-10],而传统方法提取时间长,效率较低。本实验引入微波这种快速、高效的提取手段以期达到提高多糖提取效率的目的。本实验以柚子皮为原料,采用微波辅助酶法提取柚皮多糖,在单因素基础上通过响应面优化工艺条件,为柚皮多糖的深加工和资源化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宜昌蜜柚 购于华中农业大学市场;纤维素酶(50 U/mg)、果胶酶(1000 U/mg) 上海源叶生物科技有限公司;氢氧化钠、浓硫酸、无水乙醇 均为分析纯。

RE-2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;Avanti J-E高速冷冻离心机 Beckman Coulter公司;DF-01S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海是精益有机玻璃制品仪器厂;Apha2-4 LD冻干机 CHRIST德国;AL203分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Seveneasy型pH计 梅特勒托利多(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柚皮处理 将新鲜柚子的柚皮剥下后,在55 ℃烘箱中烘干至恒重,将干柚子皮粉碎后过80目筛即得到柚皮粉备用。

1.2.2 多糖提取的单因素实验 将经过处理后的柚皮粉加入蒸馏水按照料液比1∶20,在酶解温度50 ℃、pH4下水浴浸提30 min,然后利用微波辅助提取在640 W下提取1 min,抽滤得滤液,将滤液浓缩至一定体积,加入95%乙醇静置过夜,离心,取沉淀冷冻干燥后得到柚皮粗多糖。以上述条件为基础,分别考察不同的酶解时间(10、30、50、70、90 min),不同的pH(3、5、7、9、11),不同的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50),不同的加酶比(1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、5∶2),不同的加酶量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%),不同的微波功率(160、320、480、640、800 W),不同的微波时间(0.5、1、1.5、2、2.5 min)对多糖提取得率的影响。

1.2.3 响应面优化设计 在单因素实验的基础上,选择微波功率、微波时间和加酶比,为自变量,根据Box-Behnken设计,进行三因素三水平的响应面分析实验,以多糖得率为响应值利用Design-Expert V8.0软件设计实验,并通过二次回归分析。实验因素与水平设计见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.2.4 柚皮粗多糖得率测定

得率(%)=M1/M2×100

式中:M1为冷冻干燥后柚皮粗多糖质量(g);M2为原料质量(g)。

1.3 数据处理

采用Excel对数据进行处理和绘图,其中响应面实验则采用Design-Expert V8.0软件进行设计与分析。

2 结果与分析

2.1 酶解工艺条件对柚皮多糖提取得率的影响

2.1.1 酶解时间对柚皮多糖得率的影响 由图1可知,当提取时间在10 min到30 min时,多糖的提取量增加非常明显,这是由于短时间内细胞壁的溶胀和破坏程度不够,随着溶解时间的增加,细胞破裂多糖得率增加[11-13];当酶解时间大于30 min后,细胞的破裂程度已经达到最大值,多糖的得率趋于平衡;时间过长,提取时间在50 min以后,柚皮多糖的得率反而减小,其原因是多糖的溶出已经达到平衡状态,而一些杂质随着酶解时间的增加溶出增加,还有可能是酶解时间过长溶出的柚皮多糖发生少量降解,所以最佳酶解时间应该选取30 min。

图1 酶解时间对柚皮多糖得率的影响Fig.1 The effect of time on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.1.2 pH对柚皮多糖得率的影响 由图2中可以看出当pH为3时粗多糖的得率最高,随着pH的升高,多糖得率不断降低,而当pH为6时,多糖得率又陡然升高,这可能是因为两种酶反应适合的pH范围不同,所以酶解效果随之受到影响,选择pH=3最为合适。

图2 pH对柚皮多糖得率的影响Fig.2 The effect of pH on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.1.3 液料比对柚皮多糖得率的影响 由图3可知可以看出料液比对柚皮多糖提取得率的影响非常显著,在一定范围内伴随着料液比的增加,多糖的得率呈现显著增加趋势,当料液超过1∶40多糖得率不再增加,趋于稳定。原因是多糖已经基本全部溶解,再增加溶剂的量也不会使得溶解的多糖量增加。再增加可能会使多糖的得率减少。考虑后续工艺需要浓缩多糖提取液,过量的溶剂也会加重能耗,降低效率,因此料液比选在1∶40料液比最为合适。

图3 液料比值对柚皮多糖得率的影响Fig.3 The effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2. 1.4 加酶比例柚皮多糖得率的影响 图4可以看出随着纤维素酶与果胶酶添加比例的增加,柚皮多糖的得率呈现先升高,然后趋于平稳,后降低的趋势。在加酶比例在1∶2到1∶1的范围内,柚皮多糖得率显著增加;在加酶比例为1∶1到2∶1之间时,柚皮多糖的得率基本上保持不变;而当加酶比例继续增加,到两者比例大于2∶1以后,柚皮多糖提取量下降。所以选择纤维素酶∶果胶酶为1∶1最为合适。

图4 加酶比例值对柚皮多糖得率的影响Fig.4 The effect of cellulase-to-pectinase ratio on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.1.5 加酶量柚皮多糖得率的影响 图5可以看出当加酶量在0.5%到2%时,柚皮多糖得率上升,这是因为在这个范围内,增加的酶能够与底物迅速结合,发生酶解反应,致使多糖更快的分离出来[14-15]。而酶量增加到2%以后,由于底物都已经与酶结合,酶分子出现饱和,多余的酶无法与底物结合,所以即使继续增加酶量,并不能使多糖的得率增加,多糖提取物的量趋于稳定。经分析得当加酶量为2%时,柚皮多糖得率最高。

图5 加酶量值对柚皮多糖得率的影响Fig.5 The effect of total enzyme dosage on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.2 微波工艺条件对柚皮多糖提取得率的影响

2.2.1 微波功率柚皮多糖得率的影响 由图6可以看出随着微波功率的增加,多糖得率不断升高,理论上在实验范围内微波功率越高,多糖得率越高,而在实际过程中,当微波功率800 W时,柚皮多糖提取量不仅没有升高却发生下降的情况。这是因为反应体系能量增加后会加速目标物溶出,所以多糖得率提高。当功率过高时,样品溶液的温度就会急剧升高,多糖结构可能被破坏。所以在微波功率的选择上还要结合实际情况,选择640 W的微波功率最为合适。

图6 微波功率对柚皮多糖得率的影响Fig.6 The effect of microwave power on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.2.2 微波时间柚皮多糖得率的影响 由图7在一定范围内柚皮多糖得率逐渐增加与微波时间的增加有关。微波时间继续延长,多糖得率不再提高,反而缓慢下降。微波加热可以让极性分子产生撕裂和相互摩擦发热,而这种剧烈运动则进一步使原料细胞破裂,多糖溶出[16-19]。但是微波处理时间也不能过长。因为微波过程中溶液温度会迅速升高,长时间的微波萃取会使溶剂中的水分蒸发速率增加,会导致溶解多糖的溶剂减少。甚至会让已经得到的多糖水解,所以多糖得率会有所下降。因此,最适合的微波时间为2 min。

图7 微波时间对柚皮多糖得率的影响Fig.7 The effect of microwave time on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.3 响应面法优化提取工艺条件

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,综合单因素影响实验结果,选取纤维素酶与果胶酶加酶比、微波时间、微波功率对柚皮多糖得率影响显著的三个因素,在单因素实验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法进行实验设计,实验结果见表2。

表2 三因素三水平中心组合实验方案及结果

以柚皮多糖得率为响应值,得到的二次回归方程为:

Y=-30.75500+0.12162A-13.05500B+34.43500C+0.023125AB-9.37500E-003AC+4.50000BC-1.15527E-004A2-1.33000B2-14.93000C2

应用Design-Expert 8.0软件对表2中的数据进行分析,由表3可知,模型回归p=0.0011<0.01极显著,失拟项p=0.7779>0.05不显著,说明该回归方程可以进行预测。方程系数R2=0.9468说明预测值与实际值之间有高度的相关性。

表3 回归方程方差分析

注:*表示影响显著(p<0.05);**表示影响极显著(p<0.01)。其中微波功率对柚皮多糖得率影响显著,添加酶的比例对柚皮多糖得率影响极显著,微波时间对多糖得率影响不显著。对多糖得率各因素影响主次顺序分别为加酶比(C)>微波功率(A)>微波时间(B)。模型中C、A2、C2极显著,A、AB显著。考虑因素之间的交互作用,微波时间和微波功率之间交互作用显著。

三维空间的响应面图能比较形象的反映各因素之间的交互作用。为进一步反映两变量交互作用对柚皮多糖得率影响的显著性,也作了相应的等高线图,图中,椭圆形则表示显著,而圆形表示不显著[20-21]。通过多元回归方程借助Design-Expert 8.0软件做响应面图和等高线图,微波辅助复合酶法提取柚皮多糖效果的实验中,微波功率、微波时间和加酶比之间的交互作用对柚皮多糖得率的影响如图8所示。

图8 两因素交互作用对柚皮多糖得率的响应面图Fig.8 Response surface plot of two factors on yield of polysaccharide from shaddock peel

由图8(a)可以看出,微波功率与微波时间的坡度陡峭。说明微波时间与微波功率之间交互作用显著,这也与方差分析结果一致。而且微波功率的等高线比微波时间密集,说明微波功率的主效大于微波时间。

由图8(b)可以看出微波功率与加酶比之间的等高线排列疏松且椭圆曲率小,近似圆形。说明微波功率与加酶比之间的交互作用不明显。

由图8(c)可以看出,微波时间与加酶比之间的坡度较为陡峭,说明两者有一定的交互作用,但是并不显著。

通过Design-Expert 8.0 分析可以得到提取柚皮多糖的最佳条件为:A=723.62,B=2.5,C=1.3,即微波功率为723.62 W,微波时间2.5 min,纤维素酶与果胶酶加酶比为1.3∶1,在最佳工艺情况下,最高得率为22.99%。根据实际情况对工艺参数做一定的调整为微波功率720 W,微波时间2.5 min,加酶比1.3∶1,经过三次验证实验后,得到平均柚皮多糖得率为22.8%,与理论值接近,说明该回归模型能够很好地预测微波辅助复合酶法提取柚皮多糖的得率,优化的最适条件是可靠且具有实际价值的。

3 结论

在酶法提取的基础上,利用微波辅助提取柚皮多糖,不仅能够提高多糖得率,而且具有效率高的特点。本研究在单因素实验的基础上利用Design-Expert V8.0软件设计实验,并通过二次回归分析得到了微波辅助复合酶法提取柚皮多糖得率与微波功率、微波时间、纤维素酶和果胶酶加酶比例之间关系的回归模型,分析可知该模型是可靠的,能够较好预测柚皮多糖的得率。由该模型得到的优化工艺参数为纤维素酶与果胶酶加酶比1.3∶1,微波功率720 W,微波时间2.5 min,平均柚皮多糖实际得率为22.8%。

[1]郑淑娟,罗金辉.中国柚类产业现状与发展分析[J].广州农业科学,2010(1):192-194.

[2]QIN C G,HUANG K X,XU H B. Isolation and characterization of anovel polysaccharides from the mucus of the loach,Misgurnus anguillicaudatus[J].Carbohydrate Polymer,2002,49:367-371.

[3]邓婷婷,刘素纯,贺建华.柚皮提取物有效成分的研究概况[J].中国食物与营养,2008(6):16-19.

[4]杨宁. 柚子全果综合利用及生物活性研究进展[J]. 广州化

工,2015,43(5):9-11.

[5]安晓娟,冯琳,宋红平,等.植物多糖的结构分析及药理活性研究进展[J].中国药学杂志,2012,47:1271-1275.

[6] Sui Z Q,Gizaw Y,BeMiller J N.Extraction of polysaccharides from a species of Chlorella[J].Carbohyd Polym,2012,90(1):1-7.

[7] Na Y S,Kim W J,Kim S M,et al. Purification,characterization and immunostimulating activity of water-soluble polysaccharide isolated from Capsosiphon fulvescens[J].Int Immunopharmacol,2010,10(3):364-370.

[8] 蔡为荣,孙元琳,汤坚.果胶多糖结构与降血脂研究[J].食品科学,2010(5):307-311.

[9] Luo Q,Cai Y Z,Yan J,et al. Hypoglycemic and hypolipidemic effects andantioxidant activity of fruit extracts from Lycium barbarum[J]. Life Science,2004,76:137-149.

[10]孔梦晓,方伟斐,王晓梅,等.柚皮多糖的提取纯化工艺及鉴定[J].食品工程,2011(8):157.

[11]李湘利,刘静,梁付荣,等. 微波辅助酶法提取芡实多糖工艺的响应面优化[J]. 食品科技,2012,40(2):234-238.

[12]吕长鑫,李萌萌,徐小明,等.响应面分析法优化纤维素酶提取紫苏多糖工艺[J].食品科学,2013,34(2):6.

[13]王艳艳,王团结,丁琳琳.响应面分析法优化当归多糖提取工艺[J].食品科学,2012,33(10):146.

[14]吴洪斌,王永刚,刘成江.新疆红枣多糖酶法提取工艺研究[J].食品工业科技,2012,33(5):43.

[15]Dpto I Q,Facultad C Q . The three-dimensional structures of the pecticpolysaccharides[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2000(38):37-55.

[16]谢艳娟,陈晓丹,王晓波.超声波法辅助提取芡实多糖条件优化[J].食品研究与开发,2010,31(8):15-18.

[17]卢忠英,姚元勇,陈仕学,等.响应面微波辅助酶法提取油茶枯水溶性膳食纤维的工艺研究[J].食品工业科技,2015,36(20):289-291.

[18] Zhu M Y,Wang C J,Wang X,et al. Extraction of polysaccharides from Morinda officinalis by response surface methodology and effect of the polysaccharides on bone-related genes[J]. Carbohydrate Polymers,2011,85(1):23-28.

[19]刁小琴,关海宁,马松艳,等.微波辅助响应面酶法优化南瓜多糖提取工艺的研究[J].粮油加工,2010(1):92-94.

[20]刘亚南,张志胜,佟海菊,等. 响应面法优化中性蛋白酶提取牡蛎牛磺酸酶解工艺条件[J]. 食品科学,2011,32(14):25-28.

[21]郭文,陶红,于立梅,等. 柚皮多糖提取分级及分子质量的分布[J]. 食品与发酵工业,2015,41(3):233-237.

Optimization of microwave assisted enzyme methodauthor_info_translateextraction technology of polysaccharide from shaddock peel by response surface method

LI Jing1,2,DENG Qing-yun2,LIU Ai-lu1,HUANG Wen1,*

(1.College of Food Science &Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 2.College of Life Science and Biotechnology,Hubei Engineering University,Xiaogan 432000,China)

Microwave assisted enzymaticd was used to extract polysaccharide from shaddock peel . On the basis of single factor test,the cellulase-to-pectinase ratio,microwave time and microwave power were selected as independent variables to shaddock peel polysaccharide extraction rate response by using Box-Behnken experimental and response equation. The results showed that the optimal extraction conditions were the cellulase-to-pectinase ratio 1.3∶1,reaction temperature 50 ℃,enzymolysis time 30 min,pH3,solid-solvent ratio 1∶40,microwave power 720 W,microwave time 2.5 min.Shaddock peel polysaccharides extracted utilization rate under these conditions was 22.8%.

shaddock peel;polysaccharide;extraction technology;microwave assisted enzyme method

2016-06-15

李静(1990-)，女，硕士研究生，主要从事天然产物研究，E-mail：ljlipod@sohu.com。

*通讯作者:黄文(1968-)，女，博士，教授，主要从事天然产物研究，E-mail：huangwen@mail.hzau.edu.cn。

农业部公益性行业(农业)科研专项项目(201503142-04)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000