结核感染T细胞斑点试验在辅助诊断骨结核中的应用价值▲

吴 青 吕 幸 李 艳 徐万洲 龚卫杰 吴泽刚 蔡 璇

(武汉大学人民医院检验科，武汉市 430060，E-mail：306823560@qq.com)

论著·临床研究

结核感染T细胞斑点试验在辅助诊断骨结核中的应用价值▲

吴 青 吕 幸 李 艳 徐万洲 龚卫杰 吴泽刚 蔡 璇

(武汉大学人民医院检验科，武汉市 430060，E-mail：306823560@qq.com)

目的 探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在辅助骨结核诊断中的应用价值。方法 回顾性分析137例疑似骨结核患者的临床资料，根据临床表现、影像学检查、组织病理学检查、病原学检查结果以及临床抗结核治疗效果进行诊断，确认或临床诊断骨结核患者69例，非骨结核患者68例。所有患者治疗前均行结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)试验及T-SPOT.TB，分析T-SPOT.TB在辅助诊断骨结核中的效能。结果 T-SPOT.TB辅助诊断骨结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为98.5%、91.2%、91.9%、98.4%，均高于TB-PPD试验辅助诊断骨结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值的50.7%、77.9%、70.0%、60.9%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 T-SPOT.TB可辅助诊断骨结核，其具有较高的诊断敏感性、特异性。

骨结核；结核感染T细胞斑点试验；结核菌素纯蛋白衍生物试验；辅助诊断

骨关节是肺外结核的高发部位，骨关节结核约占肺外结核的30%以上[1-3]。骨结核的早期临床症状、影像学表现均不明显，确诊需要感染组织活检检出结核分枝杆菌，而结核分枝杆菌的培养不仅取材困难，耗时长且阳性率仅有60%～80%[4]。因此，如何在早期诊断骨结核已成为临床的迫切需求[5]。近年来，一种新的早期诊断方法—结核感染T细胞斑点试验(T-cell spot test for tuberculosis infection，T-SPOT.TB)已被广泛应用于结核病的诊断等方面[6-8]。T-SPOT.TB 通过检测致敏T淋巴细胞表达的早期分泌靶抗原-6(early secreting antigenic target-6，ESAT-6)和培养滤液蛋白-10(culture filtrate protein-10，CFP-10)间接检测结核感染。抗原ESAT-6和CFP-10的编码基因位于结核分枝杆菌基因差异区1，该基因在大多数非结核分枝杆菌中缺失，因此具有较高的特异性。本文主要探讨T-SPOT.TB在辅助诊断骨结核中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年8月至2016年4月湖北省人民医院收治的疑诊骨结核患者137例，男72例，女65例，年龄12个月至87岁[(53.47±1.75)岁]；有卡介苗接种史135例(98.5%)，合并肺结核或肺结核病史17例(12.4%)，糖尿病史7例(5.1%)，器官移植史1例(0.7%)，合并恶性肿瘤4例(2.9%)、重症肝炎5例(3.6%)、慢性肾病3例(2.2%)。根据临床表现、影像学检查、组织病理学检查、病原学检查结果以及临床抗结核治疗效果等信息进行诊断分组。若患者病变部位样本中检出结核分枝杆菌则为确诊结核；若患者组织学改变符合肉芽肿性炎或干酪样坏死且抗结核治疗有效则为临床诊断结核；若诊断为其他疾病或抗结核治疗症状无明显改善则为排除结核。结果骨关节结核组69例(其中确诊26例及临床诊断骨结核43例)，其中脊柱结核37例、膝关节12例、手掌关节3例、肘关节4例、髋关节18例；排除骨关节结核的患者68例。

1.2 结核菌素纯蛋白衍生物试验 应用北京祥瑞生物制品有限公司生产的结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，TB-PPD；5支/盒，每支1 ml，国药准字：S10960018)，于患者前臂掌侧皮内注射TB-PPD[0.1 ml(2 U)]，72 h后观察注射部位皮肤的反应情况。结果判断参照《中国结核病防治规划实施工作指南》(2008版)标准[9]：硬结直径<5 mm为阴性(-)；5～9 mm为弱阳性；10～20 mm为阳性；>20 mm或局部出现水泡、淋巴管炎、坏死等为强阳性。阳性结果包括弱阳性、阳性和强阳性。检测均在患者治疗前进行。

1.3 T-SPOT.TB 收集患者新鲜肝素抗凝全血5～10 ml，在4 h内分离，按1 ∶1等比例与室温预热的RPMI-1640培养液混匀，按2～3 ∶1比例小心将血样加在Ficoll淋巴细胞分离液上层，注意不能将血样与分离液混合。在18℃，相对离心力1 000 g，离心22 min。将单核细胞层从分离管中转移到新的无菌的15 ml尖底离心管。外周血单核淋巴细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，将分离的PBMCs按试剂盒说明(T-SPOT.TB，Oxford Immunote Ltd，Abingdon，英国)(24人份/盒，批号：013)加入预包被抗人-γ干扰素抗体的板孔中(每孔约2.5×105个PBMCs，每个样品加4个板孔)，再往4个已加样板孔中分别加入阴性对照试剂(细胞培养液)、两种抗原(ESAT-6，CFP-10)及阳性对照，并置于37℃、5% CO2、保持一定湿度培养箱中孵育16～20 h，用碱性磷酸酶偶联的二抗和底物显色后，洗板后对斑点进行计数。结果判定：抗原ESAT-6或CFP-10板孔中任意1孔点数-对照孔点数≥6即为检测阳性，点数<6为阴性。检测均在患者治疗前进行。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，分别计算T-SPOT.TB和TB-PPD试验的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

T-SPOT.TB诊断骨结核的敏感度、特异度、阳性预测值以及阴性预测值均高于TB-PPD试验，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1～3。

表1 T-SPOT.TB诊断结果

表2 TB-PPD试验结果

表3 T-SPOT.TB与TB-PPD

3 讨 论

近年来，虽然经济发展快速、居住环境改善、结核检测和治疗方法不断进步，但结核的发病率却居高不下，肺外结核的发病率也随之升高[10]。骨结核作为肺外结核的重要组成部分，因其进展缓慢、临床表现无特异性，且常导致患者的骨关节被实质性破坏、预后差，给临床诊断和治疗带来极大的挑战[11]，如何早期诊断骨结核则成为了临床棘手的问题。结核感染的确诊需要病原微生物学的证据，然而结核培养需要4～6周才能获得结果。TB-PPD试验作为一个快速、简便、低成本的筛查方法，成为目前临床上诊断结核感染的常用方法。但此方法不仅受卡介苗接种的影响且与患者的免疫力状态有关，其检测的敏感度、特异度均有限[12]。本研究结果也显示，TB-PPD试验辅助诊断骨结核的敏感度仅为50.73%，特异度为77.94%。

T-SPOT.TB作为一种新型快速的免疫性诊断方法，整个检测过程仅需2 d，目前已被用于肺结核和肺外结核的诊断[13-14]。本研究旨在评价T-SPOT.TB在辅助诊断骨结核中的价值，结果显示T-SPOT.TB的敏感度为98.551%，特异度为91.176%，提示T-SPOT.TB可作为辅助诊断骨结核的有效方法。

本研究的74例T-SPOT.TB阳性患者中，有6例临床排除活动性骨结核的诊断。由于T-SPOT.TB反映的是体内结核分枝杆菌的存在与否，不能鉴别活动性结核与结核潜伏感染[15]，因此T-SPOT.TB阳性而临床排除结核诊断可能与结核的潜伏感染或既往有结核病史有关。另外，本研究中有1例临床组织病理活检发现肉芽肿性炎和干酪样坏死，而T-SPOT.TB呈阴性，最终证实为非结核分枝杆菌感染。这提示T-SPOT.TB可能可用于结核分枝杆菌感染和非结核分枝杆菌感染的初步鉴别诊断，但仍需大样本量的进一步研究证实。

综上所述，T-SPOT.TB在骨关节结核诊断中有较高敏感度、特异度，明显优于TB-PPD试验，且检测时间短、取材方便，是辅助诊断骨结核的可靠方法，值得临床推广。

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Application value of T-cell spot test for tuberculosis infection in auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis

WUQing,LYUXing,LIYan,XUWan-zhou,GONGWei-jie,WUZe-gang,CAIXuan

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To explore the application value of T-cell spot test for tuberculosis infection(T-SPOT.TB) in the auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis.Methods Clinical data of 137 patients suspected as skeletal tuberculosis were retrospectively analyzed.The patients were diagnosed according to clinical manifestation,the results of imaging examination,histopathological test and pathogen test,and clinical efficacy of antituberculosis.Of 137 patients,69 were definitely or clinically diagnosed as skeletal tuberculosis,and 68 as non-skeletal tuberculosis.All patients received both purified protein derivative of tuberculin(TB-PPD) test and T-SPOT.TB before treatment.The efficacy of T-SPOT.TB for auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis was analyzed.Results The sensitivity,specificity,positive predictive value,and negative predictive value of T-SPOT.TB for auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis were higher than those of TB-PPD test,respectively(98.5%vs. 50.7%,91.2%vs. 77.9%,91.9%vs. 70.0%,and 98.4%vs. 60.9%,allP<0.05).Conclusion T-SPOT.TB can be applied to the auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis for its high diagnostic sensitivity and specificity. 【Key words】 Skeletal tuberculosis,T-cell spot test for tuberculosis infection,Purified protein derivative of tuberculin,Auxiliary diagnosis

国家临床重点专科建设项目(财社2010305)

吴青(1985～)，女，博士，主管技师，研究方向：感染性疾病致病机制和检测技术检测研究。

李艳(1961～)，女，博士，主任技师，研究方向：感染性疾病检测研究，E-mail：yanlitf1120@163.com。

R 529.21

A

0253-4304(2016)12-1649-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.06

2016-07-25

2016-09-20)