肝动脉化疗栓塞联合细胞免疫治疗对肝癌术后预防复发的研究

陈示光 余文昌 张孔志 林海澜 周 东 叶韵彬 郝明志 陈起忠 胡育斌

(福建省肿瘤医院 1介入治疗科；2腹部外科；3内科研究室；福州市 350014)

肝动脉化疗栓塞联合细胞免疫治疗对肝癌术后预防复发的研究

陈示光1余文昌1张孔志1林海澜1周 东2叶韵彬3郝明志1陈起忠1胡育斌1

(福建省肿瘤医院 1介入治疗科；2腹部外科；3内科研究室；福州市 350014)

目的 探讨肝动脉插管化疗栓塞(TACE)联合CIK细胞免疫疗法预防肝癌切除术后复发的影响。方法 140例接受肝癌根治性切除术的患者，根据术后2个月内是否行预防性TACE及CIK治疗分为三组：术后行预防性TACE术联合CIK免疫治疗者57例为联合预防组；术后行预防性TACE术者41例为TACE预防组；仅行支持对症治疗者42例为对照组。对比分析三组患者术后1、2、3年的累积复发率及术后复发的独立危险因素。结果 联合预防组1、2、3年的累积复发率为39.9%、49.2%和57.3%；TACE预防组1、2、3年的累积复发率为43.5%、68.5%和81.5%；对照组1、2、3年的累积复发率为51.2%、61.3%和68.3%。联合预防组与TACE预防组比较，差异有统计学意义(P=0.040)，联合预防组与对照组比较，差异有统计学意义(P=0.046)，单纯TACE预防组与对照组比较，差异无统计学意义(P=0.800)。肿瘤个数是术后复发的独立危险因素。结论 术后补充TACE术联合CIK细胞免疫治疗是降低患者复发率的有效手段，对于多发肿瘤尤为显著。

癌，肝细胞；化疗栓塞；细胞因子诱导杀伤细胞；复发

肝细胞肝癌(简称“肝癌”)是常见的恶性肿瘤，其术后的高复发率是影响患者远期生存的重要因素。我们回顾性分析了福建省肿瘤医院140例肝癌根治性切除术后患者，以探讨术后辅助性肝动脉插管化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK细胞)免疫治疗的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集我院2008年9月至2012年9月接受肝癌根治性切除术的140例患者，术后均经病理证实为肝细胞肝癌。纳入标准：所有患者均接受根治性肝癌切除术，肝功能为Child-Pugh A/B级，有完整随访资料；术后1个月内行CT、MRI或血管造影检查未复发者：预防性TACE组在介入术后1个月复查CT未见明显碘油沉积。排除标准：姑息性手术或减瘤手术，术前有肝外或淋巴结转移，术后2个月内复发。根治性切除的定义为肿瘤完全切除且显微镜下切缘明确阴性，术后2个月内行腹部CT、MRI或血管造影检查未见残留病灶[1]。

1.2 方法

1.2.1 分组 根据患者及家属意愿，肝癌根治切除术后行预防性TACE术联合CIK细胞免疫治疗者57例，为联合预防组；术后行预防性TACE术者41例，为TACE预防组；仅行支持对症治疗者42例，为对照组。

1.2.2 TACE方法 TACE通常在肝癌切除术后2个月内进行，联合预防组、TACE预防组患者均行1～2次介入治疗，间隔时间不等。肝动脉插管选用Seldinger法，导管自股动脉插入肝固有动脉造影，若没有发现肿瘤血管和肿瘤染色，则先行化疗药物灌注，化疗药物包括FUDR(1.0)、表阿霉素(50 mg)、奥沙利铂(200 mg)等二者组合，之后将超液化碘油3～5 mL由导管注入。若造影发现明显肿瘤染色，则该病例视为有残余癌，以常规介入方法行肝癌TACE术治疗。

1.2.3 CIK免疫治疗

1.2.3.1 细胞的采集与培养过程 抽取患者外周血50 mL，分离血浆备用，再吸出富含白细胞层的细胞约10 mL，悬浮于等量血浆中，淋巴细胞分离液分离收集单个核细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。将细胞按2×109/L数量悬浮于RPMll 640完全培养基中，加至经抗CD3单核包被的6孔细胞培养板，每孔6 mL，加入终含量为50 kU/L rIL-2和500 kU/L IFN-Y，置于37℃ 50 ml/L的CO条件下培养，培养8～10 d后，经细菌和霉菌培养阴性后再收集细胞，无菌生理盐水洗3次，将细胞悬浮于自身血浆中，加入5×104U rIL-2，终细胞数1.3×109～1.5×109。静脉回输时配制成100 mL的细胞悬液。

1.2.3.2 CIK细胞输注 外科术后3个月内，在预防性TACE术之后，行CIK细胞的免疫治疗。将制备的细胞悬液每天输注给患者，8次为1疗程。联合预防组，TACE预防组患者均行至少1～2个疗程的免疫治疗。回输期间除个别患者低热外，未观察到其他明显副作用。

1.3 随访及研究终点 全部患者均通过电话或门诊方式进行随访。随访内容包括每个月检查血清AFP和B超，每3个月行增强CT或MRI检查，并可通过随访、病案资料得到这些信息。根据美国肝病研究学会(AASLD)肝癌诊断标准[2]，随访中出现下列情况考虑复发：术前AFP阴性者，术后一段时间后转为阳性(>200 ng/mL)；或术前为阳性，术后转阴后再次阳性，且腹部B超或CT发现肝占位>2 cm：B超发现肝内占位1～2 cm，则进一步行腹部增强CT或MRI检查，如出现典型的“快进快出”表现，可以考虑肝癌复发：对于<1 cm的不能确定性质的肝内占位，则继续随访，如继续变大则考虑肿瘤复发，并以最早发现占位的时间为复发时间。研究终点为肿瘤复发，至复发时间(TTR)定义为手术时间至诊断为肝内复发时间的间隔。随访时间终点为2015年9月或复发。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件处理数据。分类数据采用χ2检验或Fisher确切概率法。利用Kaplan-Meier计算累积复发率，Log-Rank检验评估不同组别的复发差异，Cox比例风险回归模型用于评价影响肝癌复发的独立危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组基线资料的比较 三组患者的性别构成、年龄、术前AFP水平、肿瘤直径、肿瘤个数、脉管癌栓、手术切缘等基线资料相比差异均无统计学意义。见表1。

表1 三组肝癌术后患者一般临床基线资料的比较 (n)

2.2 COX比例风险回归模型分析 经Kaplan-Meier法评估，联合预防组1、2、3年的累积复发率为39.9%、49.2%和57.3%，中位TTR为25(12.0～38.1)个月；单纯TACE预防组1、2、3年的累积复发率为43.5%、68.5%和81.5%，中位TTR为20(9.7～30.3)个月；对照组1、2、3年的累积复发率为51.2%、61.3%和68.3%，中位TTR为12(7.0～17.0)个月。经Log-rank检验，联合预防组与单纯TACE预防组差异有统计学意义(P=0.040)，联合预防组与对照组差异有统计学意义(P=0.046)，单纯TACE预防组与对照组差异无统计学意义(P=0.800)。见图1。

图1 三组患者累积复发率的曲线图

2.3 单因素分析 其他变量以同样方法行单因素分析发现，手术切缘、肿瘤个数对复发的影响差异有统计学意义(P<0.05)；而性别、年龄、术前AFP水平、脉管癌栓、肿瘤直径差异均无统计学意义。见表2。

2.4 多因素分析 将单因素分析有统计学差异的变量进一步作多因素分析，发现肿瘤个数 (单发/多发)(HR：0.426，P=0.005)、术后预防性治疗(联合预防组/单纯TACE预防组/对照组)(HR=1.680，P=0.038)是影响肝癌术后复发的独立危险因素；而手术切缘(≥1 cm/0.05) 。见表2。

表2 COX比例风险模型分析

2.5 多层分析 多因素分析有意义的变量按联合预防组与其他方法(包括单纯TACE预防组和对照组)进行分层分析显示，发现在多发肿瘤亚组中，联合预防组降低了肝癌术后的复发率，且差异存在统计学意义 (P值为0.006)。见图2。

图2 有意义的变量按是否行联合预防治疗的分层分析

3 讨 论

肝癌术后2～6个月内出现的肿瘤多为残癌，这些残癌灶由于现有影像学技术的限制而难以在术前或术中发现；手术操作不当也会增加癌细胞播散的风险[3]。因此，临床上的根治性切除并不能保证达到实际上的根除。术后综合治疗可能有助于提高手术疗效，减少术后复发。术后辅助性TACE术虽可控制术后残癌病灶，大量杀死残癌细胞，但一些微小病灶可能由于肿瘤血管尚未成熟、缺乏血供或非动脉血供等原因，对TACE的治疗反应并不理想。此时联合具有杀伤肿瘤细胞、活化产生炎性细胞、诱导细胞凋亡作用的CIK细胞，将有助于增强机体免疫反应，消灭残留的病灶及循环癌细胞，从而减少复发及转移[4，5]。

本研究结果中，联合预防组1、2、3年的累积复发率(39.9%、49.2%和57.3%)显著高于对照组(51.2%、61.3%和68.3%)，差异具有统计学意义 (P=0.046)。这表明术后补充TACE术联合CIK细胞免疫治疗对降低患者的复发率具有肯定的临床价值。有研究认为，TACE联合CIK细胞治疗，相对于单纯的TACE在治疗肝癌方面存在明显的优越性[6]。本研究结果中，联合预防组1、2、3年的累积复发率(39.9%、49.2%和57.3%)显著高于单纯TACE预防组(43.5%、68.5%和81.5%)，也证实了联合治疗的益处。许多研究认为术后辅助性TACE术可延缓术后近期复发，从而延长生存期[7]；但本研究中单纯TACE预防组与对照组差异无统计学意义(P=0.800)。这可能与肝细胞癌患者本身存在细胞免疫抑制，外科手术创伤打击及随后补充的栓塞化疗会进一步加重患者原有的免疫抑制有关，也可能与本研究样本选择上的偏倚有关。

很多学者认为，对于合并术后复发高危因素，如肿瘤直径>5 cm、多发肿瘤病灶及脉管癌栓侵犯、手术切缘<1 cm等，TACE有助于降低术后复发率[8，9]。本研究结果提示，性别、年龄、术前AFP水平、脉管癌栓、肿瘤直径差异均无统计学意义；而肿瘤个数为多发是肝癌术后复发的独立风险因素。进一步分层分析显示，对于多发肿瘤病灶的肝癌患者，术后补充TACE术联合CIK细胞免疫治疗能降低患者复发率(P=0.006)；而对于单发肿瘤病灶的肝癌患者，术后是否补充TACE术联合CIK细胞免疫治疗对降低复发率差异无统计学意义(P>0.05)。肝癌多发肿瘤病灶可能与肝癌多中心发生有关，单纯切除影像学及肉眼可见的肿瘤，术后存在微小癌灶的可能性加大，术后预防性TACE联合CIK细胞免疫治疗有助于控制甚至消灭肝内瘤灶及循环癌细胞残留。

但是，本研究仍具有以下不足：首先，本研究为单中心的回顾性研究，选取非连续病例，存在主观因素和统计学样本偏倚的影响；其次，TACE治疗次数与CIK细胞免疫治疗次数不同及肿瘤复发后的治疗不统一，均对预后产生影响。最后，本研究病例数还较少。因此，本研究的结论仍需要严格的多中心、大样本量的前瞻性临床试验证实。

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Study on transcatheter arterial chemoembolization combined with cellular immunotherapy in prevention of recurrence after hepatocellular carcinoma resection

CHENShiguang,YUWenchang,ZHANGKongzhi,LINHailan,ZHOUDong,YEYunbin,HAOMingzhi,CHENQizhong,HUYubin

(1DepartmentofInterventionalRadiology；2DepartmentofAbdominalSurgery；3DepartmentofInternalMedicine,FujianProvincialTumorHospital,Fuzhou350014,China)

Objective To investigate the effect of transcatheter arterial chemoembolization (TACE) combined with CIK cell immunotherapy in the prevention of recurrence after hepatocellular carcinoma resection. Methods A total of 140 patients with HCC treated with radical hepatectomy were analysed retrospectively.According to whether or not accepted prophylactic TACE and CIK within 2 months after hepatectomy,the patients were divided into conmined therapy group(57 cases),TACE group (41 cases) and control group(42 cases).Patients in combined therapy group were given prophylactic TACE combined with CIK immunotherapy following hepatectomy.Patients in TACE group were given prophylactic TACE following hepatectomy.Patients in control group only received supportive therapy.1-,2-,3-year cumulative recurrence rate and the independent risk factors for tumor recurrence were analyzed comparatively. Results 1-,2-,3-year cumulative recurrence rate in combined therapy group were 39.9%,49.2% and 57.3%,those in TACE group were 43.5%,68.5% and 81.5%,and those in control group were 51.2%,61.3% and 68.3%,respectively.There was significant difference between combined therapy group and TACE group(P=0.040),and between combined therapy group and control group(P=0.046).There was not significant difference between TACE group and control group (P=0.800).The number of tumors was the independent risk factor for HCC recurrence. Conclusion Adjuvant TACE combined with CIK immunotherapy after HCC hepatectomy can be an effective method for reducing recurrence rate,especially in multiple liver cancer.

Carcinoma,hepatocellular; Chemoembolization; Cytokine-induced killer; Recurrence

陈示光(1979～)，男，硕士，主治医师，研究方向：恶性肿瘤及其并发症的介入诊疗。

R 735.7

A

1673-6575(2016)03-0329-04

10.11864/j.issn.1673.2016.03.06

2016-03-07

2016-05-03)