两种粒径微球造孔剂粒径比和质量比对磷酸钙骨水泥孔隙率的影响▲

叶财敏 陈娟娟 梁翠薇 吴修团 李文良 谢柳蓉 廖红兵

(广西医科大学附属口腔医院口腔修复科，南宁市 530021)

两种粒径微球造孔剂粒径比和质量比对磷酸钙骨水泥孔隙率的影响▲

叶财敏 陈娟娟 梁翠薇 吴修团 李文良 谢柳蓉 廖红兵*

(广西医科大学附属口腔医院口腔修复科，南宁市 530021)

目的 利用两种粒径的聚甲基丙烯酸甲酯( PMMA)微球作为微球工具以不同的粒径比和质量比加入磷酸钙骨水泥( CPC)后观察其对复合物孔隙率的影响。方法 使用50 μm/15 μm PMMA微球、100 μm/50 μm PMMA微球和20 μm/15 μm PMMA微球三种粒径组合方式(微球占复合物的体积比均为50%)，每种组合中微球的质量比分别为2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3和8 ∶2，高温煅烧后用密度法计算磷酸钙骨水泥的孔隙率。结果 50 μm/15 μm PMMA微球质量比为2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3和8 ∶2时CPC复合物孔隙率分别为(70.9±1.2)%、(70.0±0.6)%、(67.9±0.7)%、(71.2±0.9)%、(68.4±0.8)%、(70.5±0.8)%、(71.2±1.8)%；100 μm/50 μm PMMA微球质量比为2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3和8 ∶2时CPC复合物孔隙率分别为(70.9±1.2)%、(71.3±2.6)%、(69.6±2.4)%、(71.1±1.5)%、(68.8±0.9)%、(69.1±1.5)%、(69.9±1.9)%；20 μm/15 μm PMMA微球质量比为2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3和8 ∶2时CPC复合物孔隙率分别为(76.7±2.9)%、(72.7±1.2)%、(70.7±0.7)%、(69.7±1.1)%、(70.8±2.1)%、(72.5±2.5)%、(66.9±1.4)%。结论 在磷酸钙骨水泥中添加相同体积的两种不同粒径微球，孔隙率会随着粒径比和质量比的变化而变化。

磷酸钙骨水泥；微球；孔隙率；聚甲基丙烯酸甲酯

外科创伤、肿瘤切除手术和高速交通事故造成的骨缺损，需要骨移植修复，同时随着人口老龄化和人们健康观念的增强，对骨移植材料的需求日益高涨。骨缺损是一个世界性的难题，自体来源骨移植组织供区少，数量有限，研究人员开始把研究重点聚焦于制备理想的骨移植替代材料。然而到目前为止，还没有制备出理想的骨移植替代材料。20世纪80年代Brown研制出可用于骨移植和修复的磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)，因其生物相容性好、骨引导性和可注射性，被视为有前途的骨移植材料。CPC最大的缺陷是降解缓慢，几乎不能诱导新生骨组织长入材料内部。近年来有研究发现通过可降解的微球与CPC复合，微球的机械强度有助于材料初始强度的提高[1]，同时随着微球的降解，形成多孔结构，促进CPC的降解，提高成骨能力，是更可行的方法[2～4]。然而先前的研究添加的微球都是同一种粒径的可降解微球，并进行动物实验[5]，还没有研究者在体外实验中利用两种粒径的可降解微球研究CPC孔隙率的变化。因此，笔者引入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球作为可降解微球的研究工具，研究两种微球不同粒径比和质量比对磷酸钙骨水泥孔隙率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 粉末状磷酸钙骨水泥(上海瑞邦生物材料有限公司)，PMMA(微球粒径分别为15 μm、20 μm、50 μm和100 μm，苏州知益微球科技有限公司)。

1.2 样本的制作和孔隙率的计算

1.2.1 样本的制作 ①PMMA微球占复合物体积比50%时，按质量比称量50 μm/15 μm PMMA微球及CPC，质量比2 ∶8(X1组)、3 ∶7(X2组)、4 ∶6(X3组)、5 ∶5(X4组)、6 ∶4(X5组)、7 ∶3(X6组)和8 ∶2(X7组)；②PMMA微球占复合物体积比50%时，按按质量比称量100 μm/50 μm PMMA微球及CPC，质量比2 ∶8(Y1组)、3 ∶7(Y2组)、4 ∶6(Y3组)、5 ∶5(Y4组)、6 ∶4(Y5组)、7 ∶3(Y6组)和8 ∶2(Y7组)；③PMMA微球占复合物体积比50%时，按质量比称量20 μm/15 μm PMMA微球及CPC，质量比2 ∶8(Z1组)、3 ∶7(Z2组)、4 ∶6(Z3组)、5 ∶5(Z4组)、6 ∶4(Z5组)、7 ∶3(Z6组)和8 ∶2(Z7组)。按0.4 ml/g的固液比例，用移液枪将4%NaH2PO4溶液混入复合物粉末中，用金属调拌刀将复合物粉末和液体调拌均匀，在15 s内将调拌好的材料装入2 mL注射器中，然后除去注射器金属针头，将材料注射入直径5 mm，高度6 mm的特氟龙管中。所有样本在恒温37°C、100%湿度的恒温水浴箱中固化24 h后脱模。每组样品制备5个。

1.2.2 密度法计算孔隙率 将固化脱模后的样品放置于60°的干燥箱中，24 h后取出。样本按编号放置于蒸发皿中，随后放入高温电炉，600°煅烧3 h。待样品冷却后分别称重记为M，游标卡尺测量样品的长度L，使用圆柱体的体积公式计算出样品体积V，根据孔隙率计算公式ε=(1-M/V×ρ)×100%计算复合物孔隙率，V为样品煅烧后的体积，ρ为CPC的理论密度。

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件分析，计量单位以(均数±标准差)表示，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐采用秩合检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

复合物孔隙率测量结果见表1。在100 μm/50 μm组，复合物的孔隙率不随微球质量比的变化而变化，不同质量比之间差异无统计学意义(P>0.05)；在50 μm/15 μm组，4 ∶6组和6 ∶4组与5 ∶5组比较，均有统计学差异(P<0.01)；在20 μm/15 μm组，2 ∶8组与5 ∶5组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，3 ∶7组、7 ∶3和8 ∶2组与5 ∶5组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。图1、图2和图3分别为50 μm/15 μm组、100 μm/50 μm组和20 μm/15 μm组在7个质量比时，复合物孔隙率的柱状图。

表1 三种不同粒径比下七个质量比时复合物孔隙率

注：*P<0.01，#P<0.05。

图1 50 μm/15 μmPMMA微球/CPC复合物在不同

质量比时的孔隙率，均与5 ∶5组比较，＊＊P<0.01。 图2 100 μm/50 μm PMMA微球/CPC复合物在不同质量比时的孔隙率，均与5 ∶5组比较，P<0.05。

图3 20 μm/15 μm PMMA微球/CPC复合物在不同质量比时的孔隙率，均与5 ∶5组比较，＊＊P<0.01，＊P<0.05

3 讨 论

3.1 磷酸钙骨水泥孔隙率的提高 CPC由固体磷酸钙盐粉末和液体组成，在合适的比例混合后形成糊状物，凝固固化后形成弱结晶缠绕的羟基磷灰石(hydroxyapatite)晶体网络，能很好地充填缺损部位。但CPC在体内降解缓慢，与新生骨组织的生长速度不匹配，动物体内移植实验发现材料未能完全降解吸收[6，7]。因而，增加CPC的降解性能是提高成骨能力的关键。

有学者指出，增加CPC基质材料的孔隙率能增加其成骨能力[5，8]。在CPC基质材料中添加一定体积的可降解的微球，随着微球的降解，形成一定孔隙率的多孔材料。添加不同粒径的可降解微球，可形成多级孔隙结构，大粒径微球可形成大孔，小粒径微球能够填充于大粒径微球之间。在添加微球体积一定时，大粒径微球和小粒径球体的组合是否对孔隙率造成影响？实验发现在100 μm/50 μm组中，各质量比之间的孔隙率两两比较均没有统计学意义(P<0.05)，提示在小粒径球体与大粒径球体的粒径比为0.5 ∶1时，微球的粒径对孔隙率没有影响。在50 μm/15 μm组中(小粒径球体与大粒径球体的粒径比为0.3 ∶1)，4 ∶6组和6 ∶4组与5 ∶5组比较，孔隙率显著降低(P<0.01)，可能原因是4 ∶6组和6 ∶4组中的两种PMMA微球数目比小于2 ∶8、8 ∶2、3 ∶7和7 ∶3组中的两种微球数目比，同时两微球的粒径比为0.3 ∶1，进而引起孔隙率的降低，提示在添加两种微球(粒径比为0.3 ∶1)时，两种微球质量比接近1 ∶1能形成较低的孔隙率，质量组合相差越大，其形成的孔隙率越大。在20 μm/15 μm组中(小粒径球体与大粒径球体的粒径比为0.75 ∶1)，2 ∶8组与5 ∶5组比较，孔隙率显著增加(P<0.01)，3 ∶7组、7 ∶3组和8 ∶2组与5 ∶5组比较，孔隙率增加(P<0.05)，可能原因是2 ∶8组、3 ∶7组、7 ∶3组和8 ∶2组球体数目比大于4 ∶6组和6 ∶4组，导致孔隙率的增加。有学者指出当两种球体的粒径比大于0.7时可认为是等大球的堆积[9]，本研究结果与其有所差别。如果20 μm/15 μm组(粒径比0.75>0.7)视为等大球，在同等体积比下，孔隙率不会随两种微球的质量比的变化而变化。提示粒径比在0.75时，两种微球的质量比越大，其形成的孔隙率越高。

本研究只设置了三个粒径比，在今后的研究中可安排多个粒径比，以期阐明粒径比对孔隙率的影响。

3.2 多孔材料孔隙率测量方法的选择 多孔支架材料孔隙率的测量方法主要有：压汞法[10]、液体置换法[11]、密度法[12]，扫描电子显微镜分析法[13]和Micro-CT图像分析法[14]等。密度法是一种简单快速的测量支架材料的孔隙率的方法，适用于不能承高压力的支架材料孔隙率的测量。本实验制备的磷酸钙骨水泥样品是规则的圆柱体，样品在煅烧后形成疏松多孔造成结构的不稳定，外力的施加可能会造成结构的破坏，因此选用密度法测量孔隙率。通过测量圆柱体的高度可计算出圆柱体的体积，进而可计算出孔隙率。

由此可见，在磷酸钙骨水泥中添加相同体积的两种不同粒径微球，孔隙率会随着粒径比和质量比的变化而变化。

[1] Cuzmar E, Perez RA, Manzanares MC, et al.In vivo osteogenic potential of biomimetic hydroxyapatite/collagen microspheres: comparison with injectable cement pastes[J].PLoS One,2015,10(7):e0131188.

[2] An J, Leeuwenburgh SC, Wolke JG, et al.Effects of stirring and fluid perfusion on the in vitro degradation of Calcium phosphate cement/PLGA composites[J].Tissue Eng Part C Methods,2015,21(11):1171-1177.

[3] Bian C, Lin H, Li X, et al.Preparation of spherical macroporous poly(lactic-co-glycolic acid) for bone tissue regeneration[J].IET Nanobiotechnol,2015,9(1):1-4.

[4] Lee K, Weir MD, Lippens E, et al.Bone regeneration via novel macroporous CPC scaffolds in critical-sized cranial defects in rats[J].Dent Mater,2014,30(7):e199-e207.

[5] Van Houdt CI, Preethanath RS, Van Oirschot BA, et al.Toward accelerated bone regeneration by altering poly(D,L-lactic-co-glycolic) acid porogen content in Calcium phosphate cement[J].J Biomed Mater Res A,2016,104(2):483-492.

[6] Ding S, Zhang J, Tian Y, et al.Magnesium modification up-regulates the bioactivity of bone morphogenetic protein-2 upon Calcium phosphate cement via enhanced BMP receptor recognition and Smad signaling pathway[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2016,145(期缺失):140-151.

[7] Do AO, K NW, Sa S, et al.Development of novel Strontium containing bioactive glass based Calcium phosphate cement[J].Dental Materials,2016,32(6):703-712.

[8] Yang B, Zuo Y, Zou Q, et al.Effect of ultrafine poly(ε-caprolactone) fibers on Calcium phosphate cement: in vitro degradation and in vivo regeneration[J].Int J Nanomedicine,2016,11:163-177.

[9] 叶大年,张金民.非等大球体的任意堆积[J].地质科学,1990(2):127-136.

[10]Al-Qararah AM, Ekman A, Hjelt T, et al.Porous structure of fibre networks formed by a foaming process: a comparative study of different characterization techniques[J]. J Microsc. 2016 May 9. doi: 10.1111/jmi.12420.

[11]Serra IR, Fradique R, Vallejo MC, et al.Production and characterization of chitosan/gelatin/β-TCP scaffolds for improved bone tissue regeneration[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2015,55 :592-604.

[12]Abd-Elrahman AA, El Nabarawi MA, Hassan DH, et al.Ketoprofen mesoporous silica nanoparticles SBA-15 hard gelatin capsules: preparation and in vitro/in vivo characterization[J]. Drug Deliv,2016,11:1-29.

[13]Park HJ, Min KD, Lee MC, et al.Fabrication of 3D porous SF/β-TCP hybrid scaffolds for bone tissue Reconstruction[J]. J Biomed Mater Res A. 2016 Mar 21. doi: 10.1002/jbm.a.35711.

[14]Eneh CT, Malo MK, Karjalainen JP, et al.Effect of porosity, tissue density, and mechanical properties on radial sound speed in human cortical bone[J]. Med Phys. 2016 May;43(5):2030. doi: 10.1118/1.4942808.

Influence of pore size ratio and mass ratio on the porosity of calcium phosphate cement with two kinds of particle size

YECaimin,CHENJuanjuan,LIANGCuiwei,WUXiutuan,LIWenliang,XIELiurong,LIAOHongbing

(DepartmentofProsthodontics,StomatologicalHospitalAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To use two different particle size of Polymeric Methyl Methacrylate(PMMA) microspheres as a tool and observe the influence of porosity of complex after adding different quality ratio tocalcium phosphate cement (CPC). Methods Adding 50 μm/15 μm PMMA microspheres, 100 μm/50 μm PMMA microspheres and 20 μm/15 μm PMMA microspheres (microspheres accounted for the volume of the complexes were 50%) to CPC, and each combination microspheres quality ratio were 2 ∶8， 3 ∶7， 4 ∶6， 5 ∶5， 6 ∶4, 7 ∶3 and 8 ∶2, respectively. Results If the 50 μm /15μm PMMA microspheres mass ratio were 2 ∶8, 3 ∶7, 4 ∶6, 5 ∶5, 6 ∶4, 7 ∶3 and 8 ∶2,the CPC composite porosity were (70.9±1.2)%, (70.0±0.6)%, (67.9±0.7)%, (71.2±0.9)%, (68.4±0.8)%, (70.5±0.8)%, (71.2±1.8)%；If the 100 μm/50 μm PMMA microspheres mass ratio were 2 ∶8, 3 ∶7, 4 ∶6, 5 ∶5, 6 ∶4, 7 ∶3 and 8 ∶2,the CPC composite porosity were(70.9±1.2)%, (71.3±2.6)%, (69.6±2.4)%, (71.1±1.5)%, (68.8±0.9)%, (69.1±1.5)%, (69.9±1.9)%；If the 20 μm/15 μm PMMA microspheres mass ratio were 2 ∶8, 3 ∶7, 4 ∶6, 5 ∶5, 6 ∶4, 7 ∶3 and 8 ∶2,the CPC composite porosity were(76.7±2.9)%, (72.7±1.2)%, (70.7±0.7)%, (69.7±1.1)%, (70.8±2.1)%, (72.5±2.5)%, (66.9±1.4)%. Conclusion When adding two kinds of microspheres with the same volume in the calcium phosphate cement ,the porosity changes with the ratio of the particle size and the mass ratio.

Calcium phosphate cement; Microspheres; Porosity;Polymeric Methyl

国家自然科学基金(编号：03101212035)

叶财敏(1985～)，男，在读硕士研究生，研究方向：口腔种植基础与临床研究。

R 318

A

1673-6575(2016)03-0319-04

10.11864/j.issn.1673.2016.03.03

2016-02-27

2016-04-24)

*通讯作者