1株具促生作用的氢氧化细菌的分离及鉴定

李忠玲 周晓伦 王卫星 牛李莹 万建新 王卫卫

摘要：为了从沙打旺（Astragalus adsurgens Pall.）根际土壤分离具有促生潜力的氢氧化细菌，鉴定其种属并研究其促生机制，利用连续通氢装置分离筛选氢氧化细菌，Salkowski比色法测定产吲哚乙酸（IAA）能力，2，4-二硝基苯肼法测定1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶活性，通用CAS平板法检测铁载体产生，再结合16S rDNA序列分析和生理生化试验结果鉴定细菌种属。结果表明，筛选出1株具有较高促生潜力的氢氧化细菌SDW-16，该菌株具有分泌铁载体的能力，产IAA的量为21.62 μg/mL，ACC脱氨酶活性为8 694.55 nmol/（mg·h）。结合生理生化和16S rDNA序列（GenBank登录号：KF835389）分析，鉴定其为荧光假单胞菌。菌株SDW-16具有多项促生特征且均高于或达到了其他报道中相关水平，說明菌株SDW-16有较高的促生潜力和研究价值，同时也初步阐明氢氧化细菌的促生机制。在荧光假单胞菌中发现氢氧化细菌尚属首次，丰富了人们对氢氧化细菌分类地位的认识。

關键词：氢氧化细菌；铁载体；IAA；ACC脱氨酶

中图分类号： Q939.9文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0500-03

E-mail：610253095@qq.com。

通信作者：王卫卫，博士，教授，主要从事豆科植物-根瘤菌共生固氮生态生理学及根际微生物多样性研究。E-mail：wwwang@nwu.edu.cn。

定植于植物根际、能对植物生长发育产生积极促进作用的细菌称为植物根际促生菌[1-2]。植物根际促生菌有直接和间接2种方式促进植物生长，直接方式包括固氮作用、产生植物生长激素、分泌铁载体、溶磷、合成1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶等，间接方式包括产生抗生素、与病原菌竞争根际有限的营养与空间、增强植物抗性等[3]。鉴于植物根际促生菌在农业生产领域的巨大应用潜力，优势植物根际促生菌的分离鉴定已经成为非常有价值的一项工作。

豆科作物的轮作、间作效益多被归功于根瘤菌的固氮作用，而已有研究表明，仅有约25%的增产效益与固氮作用相关[4-5]。王瑾等通过对固氮过程中放氢现象和根际微生物群落变化的研究，提出了“氢肥”的概念，即不含吸氢酶（without uptake hydrogenase，HUP-）的根瘤菌在固氮过程中释放的氢气能促进根际氢氧化细菌的生长进而促进植物生长[6-7]。氢氧化细菌已被归类为植物根际促生菌，在农业生产上有广阔的应用前景，因此开展与其相关的研究工作很有必要。

但是，目前关于氢氧化细菌的研究工作并不充分，虽然以前也有关于氢氧化细菌的研究，但是把氢氧化细菌作为一类植物根际促生菌，并进一步分析其促生特征的研究鲜有报道。本研究利用气体循环培养体系从豆科植物沙打旺（Astragalus adsurgens Pall.）根际土壤分离氢氧化细菌，从吲哚乙酸（IAA）、铁载体、ACC脱氨酶等方面探究其促生机制，结合16S rDNA序列分析和生理生化分析确定其分类地位，以期为发现有潜在促生价值的菌株，以及氢氧化细菌的促生机制探究作出一定贡献。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株SDW-16，笔者所在实验室从沙打旺根际土壤分离。

1.1.2主要试剂和仪器ACC、D-葡萄糖酸、α-丁酮酸，购自Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。VIS-7220N可见光分光光度计，购自北京瑞利分析仪器公司。

1.2培养基

MSA培养基参照文献[8]配制；KingB-Trp培养基参照文献[9]配制，并添加终浓度为100 mg/L的L-TrP；DF无氮培养基参照文献[10]配制；DF含氮培养基即在DF培养基中加入3.0 mmol/L ACC；CAS铁载体检测培养基参照文献[11]配制；MKB培养基参照文献[12]配制。

1.3氢氧化细菌的分离筛选

取10 g土样转移到装有90 mL无菌水的锥形瓶中，置于摇床中，180 r/min、30 min摇匀，吸取0.1 mL上层悬浮液加入0.9 mL无菌水中混匀，进行一系列10倍梯度的稀释，最终稀释倍数为10-12。从每个梯度取0.1 mL土壤稀释液于MSA无机盐平板培养基上稀释涂布，每个梯度3个重复。平板倒置于连续通氢装置（电解水制氢，浓度为0.416～2.42 mmol/L）中，于30 ℃培养14 d。分离的氢氧化细菌进行植物促生试验，筛选出具有较高促生潜力的氢氧化细菌，进一步研究其促生特性。

1.4促生特征的鉴定

1.4.1吲哚乙酸含量检测将待测菌株接种于5 mL LB液体培养基中，28 ℃、180 r/min培养24 h，取1.0 mL菌液离心（5 000 r/min、10 min）后弃上清，用无菌水洗涤2次，然后用无菌水稀释10倍。从上述菌悬液取0.1 mL（约107 CFU）接种到50 mL KingB-Trp（L-Trp终浓度为100 mg/L）培养基，于30 ℃、180 r/min摇床中避光培养72 h。

IAA含量测定根据文献[13]中的Salkowski比色法。菌株培养液于10 000 r/min离心10 min，取2.0 mL上清液加入避光的冻存管中与2.0 mL Salkowski试剂（1.015 g FeCl3·6H2O，150 mL H2SO4，250 mL ddH2O）混匀，室温暗处放置 20 min，然后在530 nm波长下测定吸光度。IAA浓度计算参照IAA标准曲线（浓度10～100 μg/mL），每株菌3个重复。

1.4.2ACC脱氨酶活性检测ACC脱氨酶阳性菌株的筛选根据其能否利用ACC为唯一氮源生长，这被看作细菌具有ACC脱氨酶活性的特征。待测菌株分别接种到DF含氮培养基和DF无氮培养基，于30 ℃培养3 d。无法在DF无氮培养基上生长，但能在添加3.0 mmol/L ACC为唯一氮源的DF含氮培养基上生长的细菌则视为ACC脱氨酶阳性菌株。α-丁酮酸标准曲线的制作及ACC脱氨酶活性的定量测定参照文献[10]中的2，4-二硝基苯肼比色法，ACC脱氨酶活性以 1 mg 菌体蛋白1 h利用ACC产生的α-丁酮酸的量表示。

1.4.3铁载体检测细菌分泌铁载体的定性检测参照通用CAS平板法[14]，并加以改进，将检测培养基分为2层，下层为供细菌生长的MKB无铁培养基，上层为CAS检测培养基，细菌在MKB无铁培养基产生明显菌落后，将CAS检测培养基倒入上述平板，放置一段时间后可见平板颜色从蓝色变为橘黄色，证明有铁载体产生，对照为不接菌的检测平板。

1.5菌株的鉴定

1.5.1细菌形态特征和生理生化特征鉴定细菌的形态和生理生化特征鉴定参照文献[15-16]中的标准步骤进行。

1.5.216S rDNA序列测定待测菌株送至生工生物工程（上海）服务有限公司进行测序。将得到的16S rDNA序列录入NCBI网站，与已知的序列比对并分析同源性。用MEGA 5.1软件和邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。

2结果分析

2.1氢氧化细菌的分离纯化

根据氢氧化细菌獨特的代谢特点，选取不含碳源的MSA无机盐培养基分离筛选氢氧化细菌，在H2、CO2、O2组成的混合气体环境中，只有氢氧化细菌才能利用H2为能源固定CO2为碳源进行化能自养生长。在MSA无机盐固体平板上于 30 ℃ 培养14 d后，从平板上挑取不同形态的单菌落進一步划线纯化，按照文献[17]中的TTC试验法对其进行吸氢酶的定性检测，得到15株氢氧化细菌，根据促生试验结果筛选出Pseudomonas fluorescens SDW-16具有较高的促生潜力。

2.2吲哚乙酸含量的检测

IAA是一种重要的植物激素，在调节植物生长发育中起重要作用，很多植物根际促生菌能分泌IAA对植物生长产生积极的影响。在KingB-Trp培养基中于30 ℃培养72 h后，按上述方法测得菌株SDW-16产生IAA的量为（21.62±0.30） μg/mL。

2.3ACC脱氨酶活性的检测

3讨论

植物根际促生菌能有效促进植物生长，且不会像传统化学肥料引起环境污染等问题，其在世界上一些地区的实际应用中取得了良好的效果，在农业生产应用中有巨大的潜力，与其相关的研究已得到重视[18]。王瑾等的研究已经证实，氢氧化细菌也属于一类根际促生菌，而且通过大田试验和实际农业生产应用证实了氢氧化细菌的促生能力[6]。氢氧化细菌独特的代谢特点使其成为根际促生菌家族中的独特种群，豆科植物中有很多是重要的经济作物，其根瘤附近的富氢环境非常适宜氢氧化细菌生长，因此笔者选择豆科植物沙打旺根际土壤为研究材料，通过连续通氢装置模拟豆科植物根际的富氢环境，并利用不含碳源的MSA无机盐培养基对其进行富集和分离，高促生潜力氢氧化细菌的研究工作对农业增产尤其是豆科作物的增产有广阔的应用前景。

结合16S rDNA序列及生理生化特征结果进行分析，氢氧化细菌SDW-16 被鉴定为荧光假单胞菌（P. fluorescens），

在荧光假单胞菌中发现氢氧化细菌尚属首次，这一发现能丰富人们对氢氧化细菌分类地位的认识。荧光假单胞菌是一种重要的植物根际促生菌，SDW-16的促生特征分析很好地印证了这一点，其具有多项植物根际促生菌具备的重要促生特征，尤其是具有很高的ACC脱氨酶活性，植物在干旱、水灾、盐碱等逆境条件中会产生过量乙烯抑制其生长，ACC脱氨酶能裂解乙烯的前体ACC为氨和α-丁酮酸，降低植物体内乙烯水平，减轻对植物生长[JP3]的损害，所以产生ACC脱氨酶是重要的促生机制之一[19]。氢氧化细菌SDW-16的ACC脱氨酶活性高达8 694.55 nmol/（mg·h），远高于魏素娜等研究中AS[1 116 nmol/（mg·h）、CS （1 002 nmol/（mg·h） ]2株菌[20]；高于Grichko等研究中所有的ACC脱氨酶阳性菌株[21-22]；高于Rashid等研究中68%的ACC脱氨酶阳性株菌，与菌株YsS3[8 580 nmol/（mg·h）]的酶活相当[23]。本研究表明，ACC脱氨酶活性在2 100～5 200 nmol/（mg·h） 之间的菌株能明显促进番茄和油菜的生长，并显著增加其抗涝性和耐盐性[21，24]，而吉云秀等研究中证实PGPR的促生效果与ACC脱氨酶活力呈显著正相关性[22]，可见就ACC脱氨酶活性而言氢氧化细菌SDW-16有很高的促生潜力。

IAA在植物生长发育过程中起重要作用，微生物包括细菌、真菌也能产生IAA。氢氧化细菌SDW-16产生IAA的量为21.62 μg/mL，达到了较高水平，高于Jalili等研究中全部菌株的产量[24]，高于Tsavkelova等研究中63.6%的IAA阳性菌株[25]，而本研究中添加的Trp终浓度为 200 mg/L。在KingB-Trp培养液中加入IAA的前体物质色氨酸可以促进IAA的产生。IAA含量测定选在菌株培养72 h后，因为此时细菌处于稳定期，培养液中IAA含量最高，IAA见光易分解，所以相关步骤采取避光措施以减少对试验结果的干扰。

铁载体是细菌在铁缺乏环境中分泌的一种对Fe3+有很强特异螯合作用的低分子量化合物，在铁胁迫环境中铁载体产生菌可以分泌铁载体螯合周围的Fe3+，从而促进自身生长[26]；同时还能抑制病原菌吸收Fe3+，通过抑制病原菌的生长间接促进植物生长。CAS 检测平板由蓝色变为橘黄色表明，菌株SDW-16具有分泌铁载体的能力。

综上所述，氢氧化细菌SDW-16具有分泌IAA、产铁载体和ACC脱氨酶3项重要的促生特征，从已发表文献中相关菌株的比较来看，其分泌IAA能力和ACC脱氨酶活性均高于或达到相关菌株的水平，说明氢氧化细菌SDW-16有很高的促生潜力和研究价值。氢氧化细菌对植物的促生能力可能与IAA、产铁载体、ACC脱氨酶有关，后续工作要开展验证其实际促生效果的研究，如盆栽和田间试验等，为以后将其作为生产微生物肥料的优质菌种和应用于实际农业生产提供理论依据。

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