不同环境丰富度设置下猪血清蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析研究

席赫岐，史秀丽

（1.郑州市第一中学，河南 郑州 450052；2.郑州市电子信息工程学校）

不同环境丰富度设置下猪血清蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析研究

席赫岐1，史秀丽2

（1.郑州市第一中学，河南 郑州 450052；2.郑州市电子信息工程学校）

为考察不同环境丰富度设置对猪血清蛋白质图谱的影响，以不同环境丰富度设置下的猪血清为材料，分别针对猪血清1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的稀释倍数和12%、10%、8%的分离胶浓度进行猪血清蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳参数优化，并对猪血清蛋白质图谱进行分析。结果表明：猪血清的适宜稀释倍数为1∶9；8%分离胶对于大于60kDa和小于50kDa的蛋白质分离效果较好，12%分离胶对于50～60kDa间蛋白分离效果较好；共分离到猪血清蛋白质21种，18种为各组样品中均表达的蛋白质，3种为试验组中差异化表达的蛋白，其中215.11kDa蛋白在试验组各样品中均表达；65.29kDa和52.04kDa这两个蛋白分别仅在试验组的样品3、样品2中表达。说明不同环境丰富度设置可以引起猪血清蛋白的差异化表达。

环境丰富度；猪血清蛋白；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质图谱

动物血清中含有多种蛋白质，它们各自有独特的结构和分子量，其含量的变化与动物的营养状况、亲缘关系、疾病诊断具有重要关系［1］。血清蛋白质的研究常常是利用电泳技术，把血清中不同蛋白质分离，进行蛋白质图谱、不同蛋白质的定量定性与差异化分析。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以凝胶为支持物，根据凝胶孔径大小不同，利用样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应实现不同蛋白质的分离。该电泳具有所需样品量少、分辨率高、结果可以永久保存、便于样品的分离、纯度鉴定、多态性分析与分子量测定等优点［2］，正在被越来越多的血清蛋白质研究者所应用［3-5］。

猪血清蛋白质是一种重要的质量性状生化遗传标记，其蛋白质图谱分析对猪的遗传育种、饲养环境评价和疾病诊断有重要意义［6］。然而目前针对猪血清蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的研究报道较少。闫美荣等［7］利用不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳，把血清进行1∶2稀释，分别采用7%和10%凝胶浓度，分析了黑猪血清蛋白质和碱性磷酸酶同工酶生化位点遗传多态性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作难度比较大，影响因素比较多，其中凝胶浓度的确定、样品上样量的多少是保障蛋白质分离效果的基础，然而针对猪血清蛋白质电泳有关胶浓度、上样量优化参数以及利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳研究不同环境丰富度设置下猪血清蛋白质图谱的研究未见报道。该研究以不同环境丰富度设置下的猪血清为材料，针对血清稀释倍数、分离胶浓度进行猪血清蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳参数优化与猪血清蛋白质图谱分析研究，目的是建立稳定的猪血清SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳体系，为猪血清蛋白质组学研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 猪血清 猪血清来自河南某规模猪场不同环境设置下的皮特兰猪血清。环境设置以常规养殖环境为对照，在试验组圈舍内增加利于猪只啃咬、玩耍的铁链、轮胎等玩具以增加圈舍内的环境丰富度。血清的采集分别从对照组、试验组随机选取3头猪，从耳静脉采血5～10 ml，静置30 min，3 000 r/min 20 min，-20℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 标准蛋白质MARKER（20 to 220 kDa），分子量依次为220、120、100、80、60、50、40、30、20kDa。电泳试剂为三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基磺酸钠（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甘氨酸、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、甲醇、冰乙酸等。

1.1.3 仪器与设备 H-1850R台式高速冷冻离心机，DYCZ-24DN型双垂直电泳仪，DYY-2C型双稳定时电泳仪电源。

1.2 试验方法

1.2.1 血清稀释 猪血清稀释倍数按照文献［8］方法，取猪血清蛋白质样品，用pH6.8Tris-HCL缓冲液分别做1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10稀释混匀后，在沸水浴中加热3～4 min，冷却后备用，上样量为10 μl，浓缩胶为3%、分离胶为12%，进行电泳，考察样品稀释倍数对电泳效果的影响。

1.2.2 分离胶浓度的选择 根据确定的样品稀释倍数，分别采用8%、10%、12%的分离胶进行电泳，标准marker的上样量为5 μl，样品上样量10 μl，考察分离胶浓度对猪血清蛋白质电泳效果的影响。

1.2.3 猪血清蛋白质图谱分析 按照参考文献［9］，以标准蛋白质的迁移率为横坐标，以其对应蛋白分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线，根据样品蛋白的迁移率计算相应蛋白的相对分子质量。

2 结果与分析

2.1 样品稀释倍数对电泳效果的影响

血清中含有多种蛋白质，其中以白蛋白为最多，占血清蛋白的60%以上。相同上样量情况下，适宜的稀释倍数决定了蛋白质的分离效果，猪血清蛋白质样品适宜稀释倍数为1∶9。

2.2 分离胶浓度对猪血清蛋白质电泳效果的影响

分离胶浓度不同，形成的凝胶孔径不同，凝胶孔径的大小随凝胶浓度的增加而降低。通常需要根据分离蛋白分子量的大小配制不同孔径的凝胶。标准蛋白marker在12%、10%、8%的分离胶中，分别跑出7、6、6条带；在12%分离胶中，大于60kDa的蛋白质分离效果不好，50～60kDa蛋白分离条带较为清晰，40～50kDa蛋白质分离效果不好；在10%分离胶中，大于60kDa的蛋白质分离条带中明显优于12%分离胶，但是各蛋白质条带间距离较小，分子量在60kDa左右的蛋白质分离条带不够清晰。比较3种分离胶对猪血清蛋白质电泳效果，可以明显看出，8%分离胶对于大于60kDa蛋白质的分离效果最好，小于50kDa蛋白质的分离效果优于10%、12%的分离胶效果；但对于50～60kDa蛋白质分离效果以12%分离胶效果较好。

2.3 不同环境丰富度设置下猪血清蛋白质图谱分析

根据8%分离胶电泳结果，建立蛋白质Marker的标准曲线，见下图。根据试验组、对照组每一条带分离蛋白的迁移率，可以获得相应蛋白的相对分子量，见下表。可以看出，8%分离胶共分离到19种蛋白质，其中16种蛋白质是所有猪血清共有的蛋白，分子量分别为319.52、275.64、231.63、177.28、156.74、133.10、113.02、101.12、91.03、75.29、65.29、63.26、57.53、48.85、43.27、41.26kDa。差异化表达的蛋白3种，分子量分别为215.11、65.29、52.04kDa。差异化表达的3种蛋白均出现在试验组，其中215.11kD的蛋白在试验组中均出现，而在对照组中均不表达；65.29kDa和52.04kDa这两个蛋白仅在试验组的样品3、样品2中分别表达，在其他各组样品中均没有表达。在每种样品中表达量较多的蛋白依次为75.29 kDa、65.29 kDa、91.03 kDa、43.27 kDa、177.28 kDa，并且在各样品中表达量无显著差异；而分子量为63.26kDa，虽然在所有样品中都表达，但是在样品3中的表达量明显少于其他各样品。说明试验组中不同环境设施的增加，可以引起猪血清蛋白的差异化表达。

图 蛋白质Marker8%分离胶的标准曲线

表 不同环境设施下8%分离胶猪血清蛋白质图谱分析

3 结论与讨论

3.1 不同分离胶浓度对猪血清蛋白电泳效果的影响

正确选择适宜凝胶浓度是SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳成败的关键［10］。凝胶浓度不同，电泳分辨率不同。该研究表明：不同的分离胶浓度，蛋白质的泳动速率、带间距离、条带数量不同。比如12%分离胶时，各样品中50～60kDa蛋白均可清晰分离到4条带；而在8%分离胶中，条带有重合现象，大部分样品都少于4条带。但是在8%分离胶中大于60kDa和小于50kDa的蛋白质分离效果显著优于10%和12%的分离胶。该研究根据8%分离胶可分离到19种猪血清蛋白，而结合12%分离胶，则可以分离到21种猪血清蛋白，其中大于60kDa蛋白有14种，50～60kDa蛋白有4种，小于50kDa蛋白3种，远高于文献［7］所报道分离到黑猪血清蛋白10～12种。由此可见，分离任何一种混合蛋白，仅用一种凝胶浓度不能确定是否为最佳分离效果，需要将具有不同分子筛效应的一系列浓度的凝胶加以比较，才能根据蛋白质的不同分子量范围筛选出最合适的相应凝胶浓度。

3.2 不同环境丰富度设置对猪血清蛋白质图谱的影响

猪血清蛋白质图谱可以反映猪只血液中蛋白质状况，其表达量的多少和差异化表达，可以用来评价猪只的健康水平。在猪舍内提供利于猪只天性表达的玩具等设施提高饲养环境的丰富度，是改善动物福利，实现健康养殖的有效措施［11］。环境丰富度的增加，促使畜禽能在“自然”环境中表现其“天性”行为，使其心理和生理都达到健康状态［12］。该研究表明，在增设利于猪只啃咬、玩耍的铁链、轮胎等玩具的试验组猪只都差异化表达了215.11kDa蛋白，结合文献［13］猪血清醋酸纤维薄膜电泳图谱，推测该蛋白可能是免疫球蛋白的一种。此外65.29kDa和52.04kDa这两个蛋白分别仅在试验组的样品3、样品2中表达，产生这种现象的原因可能与猪只个体对环境丰富设施如铁链或者轮胎的偏好倾向性不同有关，还有待进一步研究。

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1004-5090（2016）12-0009-03

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