鸡沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验

闫瀚坤，张雪铭，刘保臻＊，吴玉臣

（1.睢县畜牧局，河南 睢县 476900；2.河南牧业经济学院）

鸡沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验

闫瀚坤1，张雪铭2，刘保臻2＊，吴玉臣2

（1.睢县畜牧局，河南 睢县 476900；2.河南牧业经济学院）

用饲料厂常用饲料添加剂对临床分离的沙门氏菌进行药敏试验，为饲料厂选用合适饲料添加剂提供参考。从河南各地养鸡场蛋鸡病料（鸡白痢疑似病例）中分离出沙门氏菌，选取临床常用几种不同的抗菌药物以4个浓度梯度自制药敏片，药敏试验测定它们的抑菌效果。此次分离的沙门氏菌对金霉素和喹乙醇低敏，且各类饲料添加剂浓度梯度间的效果差异不显著（P＞0.05），在高浓度下对硫酸粘杆菌素高敏，在中低浓度下对硫酸粘杆菌素中敏，各地区间的效果差异不显著。

鸡白痢；沙门氏菌；分离鉴定；抑菌浓度；药敏试验

沙门氏菌病是各种动物由沙门氏菌属细菌引起的疾病总称，临诊上患鸡白痢的雏鸡多表现为排稀薄糊状粪便，成年鸡产蛋率、受精率、孵化率下降。蛋内感染的雏鸡，形成死胚或弱雏，出壳不久无症状死亡。出壳后感染的，4～5日龄常呈无症状急性死亡，7～10 d发病增多，2～3周龄达到高峰，死亡率达40%～70%。3周龄以上较少死亡，不死者终生带菌［1-2］。该研究通过对蛋鸡病料（鸡白痢疑似病例）进行病原的分离、鉴定，选用几种临床常用药物饲料添加剂分别以常用添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4个浓度梯度稀释成混悬液，自制药敏片对病原分离株进行药敏试验，以测定病原分离株对不同浓度的常用药物饲料添加剂的敏感程度，确定药物饲料添加剂的品种和参考用量，为制定合理的防制措施提供科学依据，提高养殖户的经济效益。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药物饲料添加剂 50%喹乙醇，每吨饲料中添加200 g；20%金霉素，每吨饲料中添加250 g；10%硫酸粘杆菌素，每吨饲料中添加200 g。

1.1.2 病料 来自开封、洛阳、信阳、新乡规模化蛋鸡场，采集自然发病鸡（鸡白痢疑似病例）的肝、脾及泄殖腔分泌物［3］。

1.1.3 主要试剂 麦康凯琼脂，SS琼脂培养基，MH琼脂，营养琼脂，营养肉汤。

1.1.4 主要用品 “双圈牌”定性滤纸，微量生化鉴定管。

1.1.5 主要仪器 立式压力蒸汽灭菌器，数显电热培养箱，超净工作台。

1.2 试验方法

1.2.1 病原分离 将采集的病样无菌操作接种于普通营养肉汤培养基中，37℃温箱内增菌培养12～24 h。然后，用接种环蘸取少量普通肉汤分别在SS、麦康凯和普通琼脂平板上划线，置于37℃培养24 h。观察平板上单个菌落的颜色、大小、光滑度、湿润度和透明度，挑取独立、较大的疑似沙门氏菌菌落进行染色镜检，观察到符合沙门氏菌形态及染色特征的菌落的其余部分接种于普通琼脂斜面进行增菌备用。

1.2.2 生化鉴定 制备三糖铁和生化试验培养基，将镜检符合沙门氏菌的纯培养物进行糖类发酵试验及生化反应，主要包括葡萄糖、乳糖、山梨醇、尿素酶、靛基质、MR试验、VP试验、枸橼酸盐产气试验、硫化氢试验等。

1.2.3 药敏试验

1.2.3.1 药敏片的制备 选质量较好的滤纸片，用打孔器将定性滤纸制成直径为6 mm的纸片，每50片放入一个洁净干燥的青霉素小瓶中，装32瓶，121℃高压灭菌15 min，取出后放入温箱，干燥备用。在无菌条件下，将新霉素、硫酸粘杆菌素、硫酸安普霉素、金霉素、喹乙醇、泰乐菌素、土霉素、林可霉素以添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4种浓度梯度配成混悬液。将药敏片放入配制好的混悬液中，混合均匀后用镊子夹出，放入4℃冰箱冷藏，将药敏片平铺在灭菌平皿中放入37℃温箱中干燥后，放入灭菌青霉素小瓶中加盖灭菌橡皮塞，4℃保存备用。

1.2.3.2 MH平板的制备 在无菌条件下，将灭菌后的MH琼脂倾注至无菌平皿，待培养基冷却后形成4 mm的平板。取出一个MH平板置于37℃温箱中培养24 h做无菌试验，其余用密封袋封好置4℃冰箱保存，备用。

1.2.3.3 试验方法 采用药物纸片琼脂扩散法。用无菌小棉签蘸取菌液，在管壁上旋转挤压去掉多余菌液，涂布整个MH琼脂培养基表面，反复3次，每次将平板旋转60°，最后沿周边绕两圈，保证涂布均匀。贴上制备好的药敏纸片，每块平板贴同种药的药敏片4种浓度各1片。将平板倒置，37℃孵育18～24 h后取出，测量抑菌圈直径。抑菌圈不明显的和抑菌圈过大的平板要做补充试验。

2 结果与分析

2.1 病原菌的培养特性

分离的病原菌在普通琼脂培养基上形成圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色、直径2～3 mm的菌落；在麦康凯琼脂培养基上形成无色、透明的菌落；在SS琼脂培养基上形成无色、透明或半透明、中央显黑色的菌落；在普通营养肉汤中生长贫瘠，形成较小菌落。革兰氏染色镜检可见红色、两端钝圆、短杆状，单个、成对或成丛排列。以上结果均符合沙门氏菌特征。

2.2 分离菌的生化试验

对分离到的致病菌进行了如下（表1）生化试验，结果均符合沙门氏菌的特征。

表1 分离菌的生化试验结果

2.3 药敏试验

以抑菌圈直径大小作为敏感性高低的标准，直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。药敏试验参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的标准进行对照。抑菌圈直径在15 mm以上为高敏，10～14 mm为中敏，10 mm为低敏，0 mm为耐药［4］，结果显示平均抑菌圈直径随药品溶液浓度增大而增大，不同药物的作用效果有显著差异，但各浓度梯度间及各地区间差异不显著（P＞0.05）（见表2）。此次分离到的致病性沙门氏菌菌株对金霉素和喹乙醇低敏，在中低浓度下对硫酸粘杆菌素中敏，在高浓度下对硫酸粘杆菌素高度敏感，沙门氏菌对金霉素和喹乙醇的耐药性较高。

3 讨论

通过对来自开封、信阳、洛阳、新乡自然发病疑似鸡白痢病鸡体内病原菌的分离鉴定及生化试验，确诊为沙门氏菌引起的鸡白痢。选取3种临床常用药品饲料添加剂，分别以常用添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4个浓度梯度制作药敏片对分离鉴定株进行药敏试验，结果显示随着金霉素和喹乙醇药物浓度的升高，沙门氏菌对药物的敏感性降低，不同药物的作用效果有显著差异，但各地区间差异不显著（P＞0.05）。

该次试验从病鸡体内分离到鸡白痢沙门氏菌，并通过药物敏感性试验对该菌的药物敏感性做了初步研究。试验结果表明，随着饲料添加剂浓度的增加，沙门氏菌对金霉素和喹乙醇的敏感性降低，可以看出对金霉素和喹乙醇呈现出不同程度的耐药性，且有报道称家禽在使用喹乙醇中有中毒现象［5］。硫酸粘杆菌素可以用于治疗沙门氏菌引起的肠道感染、腹泻等，该研究证实硫酸粘杆菌素在中低浓度下对沙门氏菌中等敏感，这与李梦云等［6］的研究结果一致，在高浓度下对沙门氏菌高度敏感、有明显的抑菌效果，但过度使用亦可能造成细菌产生耐药性，因此，建议在临床使用其进行促生长时不可盲目加大剂量。近年来，滥用这几类抗微生物药，已经造成敏感菌产生了巨大的耐药性，为感染性疾病的治疗带来了巨大的困难。因此，应对患病区域进行定点定时监测，防止由于盲目用药而造成耐药敏感菌产生，减少由此带来的经济损失［7-8］。同时应加强饲养管理，增强抗病能力；对于患病猪进行无害化处理，做好消毒工作，保持良好的卫生条件。

表2 不同药物的作用效果

［1］陈溥言.兽医传染病学［M］.北京：中国农业出版社，2013.

［2］甘孟侯.禽病诊断与防治［M］.北京：中国农业出版社，2002.

［3］钟兴福，黄小华，何旭梅，等.家禽病料的采集及注意事项［J］.广西畜牧兽医，2013，29（6）：350-351.

［4］韩春.猪源致病性大肠杆菌的流行调查及药敏试验［J］.中国畜禽业，2014，（1）：113-115.

［5］张忠群.家禽几种药物中毒及其应对措施［J］.养殖技术顾问，2012，（2）：143-143.

［6］李梦云，胡迎利，乔宏兴，等.硫酸粘杆菌素体外抑菌效果的研究［J］.郑州牧业工程高等专科学校学报，2014，34（2）：8-10.

［7］辛文娟，朱斌斌.肉杂鸡白痢的诊断与治疗［J］.中兽医医药杂志，2014（1）：66.

［8］陈江.鸡白痢的诊断与治疗［J］.中国畜牧兽医文摘，2016，32（3）：215.

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1004-5090（2016）12-0003-03

2016-10-13）