杂交兰种质资源遗传多样性的SRAP分析

钟淮钦，林榕燕，黄敏玲*，林 兵，陈南川

(1.福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院花卉研究中心，福建 福州 350013；3.福建省特色花卉工程技术研究中心，福建 福州 350013；4.福建百秾生态科技有限公司，福建 诏安 363500)

杂交兰种质资源遗传多样性的SRAP分析

钟淮钦1,2,3，林榕燕1,2,3，黄敏玲1,2,3*，林 兵1,2,3，陈南川4

(1.福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院花卉研究中心，福建 福州 350013；3.福建省特色花卉工程技术研究中心，福建 福州 350013；4.福建百秾生态科技有限公司，福建 诏安 363500)

采用SRAP 技术对24份杂交兰种质资源的遗传多样性进行分析。筛选出的11对引物组合共扩增出119条谱带，其中102条为多态带，多态性比率86.1%，平均每对引物组合产生9.3个多态性位点。各种质之间的相似系数变化范围为0.43～0.98，平均为0.67。UPGMA 聚类分析表明：在遗传相似系数0.69处将24份供试材料划分为5个类群，较好地揭示了杂交兰种质间的遗传多样性与亲缘关系，可为杂交兰种质资源利用、杂交育种亲本选择及杂种后代鉴定提供科学依据。

杂交兰；SRAP；遗传多样性；聚类分析

杂交兰Cymbidiumhybrid是兰属CymbidiumSw.地生兰和附生兰种间杂交培育而成的兰花新种类，集地生兰的植株小巧、幽香、典雅和附生兰的花大、色纯靓丽等优异特性，花期长，有花观花、无花观叶，观赏价值和经济价值高，逐渐成为消费市场的新宠，开发潜力巨大[1-2]。目前，国内杂交兰品种的选育研究尚处于起步阶段，亲本及商业应用品种主要来源于韩国、日本、美国等国家和我国台湾地区。且随着产业的不断开发，不同地域间相互引种，出现了“同物异名”和“同名异物”的现象。因此，建立一种快速、准确的种质鉴定评价方法，对杂交兰种质资源保存、种质创新、品种规范管理、知识产权保护及推广应用等具有重要的理论依据和应用价值。

SRAP(sequence-related amplified polymor-phism，相关序列扩增多态性)是一种新型的PCR 分子标记技术[3]。该标记结合了RAPD 和AFLP 的优点，具有操作简单、稳定、可重复、高共显性、谱带易分离及测序、在基因组中分布均匀等特点[4-5]，已应用于国兰[6-8]、大花蕙兰[9]、文心兰[10]、矮牵牛[11]、苦瓜[12]、花椰菜[13]、油菜[14]、荔枝[15]、棉花[16]和红麻[17]等多种植物种质遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位、重要性状标记及比较基因组学研究等。目前，国内对杂交兰的研究主要集中在种子无菌播种与组培快繁[18-21]、种苗培育[22]、栽培生理[23]和染色体研究[24]等方面，而应用SRAP分子标记技术对种质资源遗传多样性分析的文章未见报道。因此，本研究通过对收集、保存的24份不同类型的杂交兰种质进行SRAP分析，探究其种质资源遗传多样性水平，以期为品种鉴定、杂交育种中的亲本选配和种质资源的科学合理利用提供科学依据与技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种的试样采集于福建省农业科学院作物研究所兰花种质资源圃，共24份，其编号及品种名等详见表1。试验在福建省特色花卉工程技术研究中心花卉分子育种实验室完成。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 取不同种质同一生长期幼嫩叶片，采用改良的CTAB法[25]提取基因组DNA。提取的DNA 原液经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度后，稀释至100 ng·μL-1，于-20℃冰箱内保存备用。

表1 杂交兰供试材料Table 1 Cymbidium hybrids examined

1.2.2 SRAP-PCR扩增 参考Budak 等[26]的引物，由8 条正向引物和10条反向引物，随机组成80对引物组合；SRAP-PCR 反应体系25.0 μL，其中10×Buffer 溶液(含Mg2+)2.5 μL、dNTPs 溶液(2.5 mmol·L-1)2.0 μL、Taq DNA 聚合酶0.25 μL、正反引物(10 mmol·L-1)各1.0μL、模板DNA (100 ng) 1.0 μL、超纯水17.25 μL；采用变温复性反应程序：94℃预变性4 min，前5个循环35℃复性，后30个循环50℃复性；最后72℃延伸10 min。反应在ABI-9700 PCR 仪上进行。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶、120 V 恒压电泳，以DL2000 DNA marker为对照，溴化乙啶染色后紫外凝胶成像仪观察照相。

1.3 数据处理

根据电泳结果，每个样品中存在的稳定条带记作1，缺失的记作0，强带和可重复弱带均记作1，采用Excel 统计软件建立原始二元数据矩阵。采用DPS统计软件对原始数据矩阵进行分析，按类平均法(UPGMA)进行聚类分析构建聚类图，并计算遗传相似性系数(GS)。

2 结果与分析

2.1 扩增产物多态性分析

从80对引物组合中筛选出条带清晰、稳定、多态性好的引物11对，对24份杂交兰种质进行SRAP-PCR扩增(图1为引物组合Me3+Em3和Me6+Em2的扩增图谱)。11对引物共扩增出119条清晰条带，DAN 片段大小为200～2 000 bp，平均每对引物获得DNA 条带10.8条；其中多态性谱带102条，多态性比率为86.1%(表2)。表明SRAP 标记在杂交兰种质中具有较为丰富的遗传多态性。

2.2 遗传相似性分析

根据SRAP 标记的分析结果，24份供试材料间的遗传相似系数GS 为0.43～0.98，平均为0.67。表明杂交兰种质间有着丰富的遗传多样性。‘绿翡翠’与‘立叶大凤’、‘韩国小姐’与‘爪艺韩国小姐’、‘樱花’与‘K40-2樱花’之间的遗传相似系数GS 很高，分别达到0.96和0.98，遗传距离很近；‘樱花’与‘绿翡翠’、‘黄金龙’的遗传相似系数GS 最低为0.43，遗传距离最远；而大部分种质间的遗传相似系数在0.50～0.90。结果表明，多数杂交兰品种间表现出一定的遗传相似性，少数品种间存在中等程度的遗传差异。

表2 SRAP 引物组合的扩增结果Table 2 Results and polymorphism of SRAP primer combinations

2.3 聚类分析

利用UPGMA法对24份杂交兰种质的SRAP 扩增结果进行聚类分析，建立亲缘关系聚类图(图2)。当遗传相似系数为0.69时，供试材料可划分为5个类群：第Ⅰ类群主要由5个黄色系和3个红色系种质组成，春节前后开花；第Ⅱ类群由6个红色系和1黄色系中花种质组成；第Ⅲ类群由2个花瓣暗红色、唇瓣黄喉的单株组成；第Ⅳ类群由4个黄色系种质组成；第Ⅴ类群由3个粉红色系种质组成。

当遗传相似系数为0.78时：第Ⅰ类群种质可分为4个亚类，第1亚类为品种‘金龙爪’，花朵深黄色，叶片爪艺；第2亚类由‘立叶大凤’、‘绿翡翠’、‘玉凤’和‘黄金龙’等4个种质组成，黄色素花，微香；‘韩国桃花’单独为第3亚类，花瓣铜红色带暗红斑纹；第4亚类由来源于同一亲本的品种‘华韵丹霞’和‘华韵红霞’组成，花瓣红色带胭脂红斑。第Ⅱ类群种质可分为3个亚类，第1亚类包括‘爪艺韩国小姐’、‘韩国小姐’、‘紫元素’和‘西施’等4个红花系品种；第2亚类由‘醉美人’和‘金玉满堂’组成，橘红或橙红花瓣带胭脂红斑纹；第3亚类为‘黄金美人’，金黄色素花，花大，香气浓。第Ⅳ类群可分为3个亚类，第1亚类为品种‘十八格格’，青黄色花瓣，白色唇瓣带淡粉色虎斑；第2亚类由‘夏日香水’和‘东方快车’组成，花瓣青黄或米黄色，唇瓣带深红斑块，秋季花；第3亚类为‘黄金小神童’，金黄色素花，浓香。第Ⅴ类群‘台北小姐’与‘樱花’花型、叶型完全不同，为什么会聚为一类，还有待进一步确认。

3 讨论与结论

杂交兰已成为消费市场的新宠，具有很高的观赏和经济价值。掌握种质资源的遗传多样性，可以减少新品种选育中亲本选配的盲目性，提高育种效率；同时也可以对一些‘同物异名’或‘同名异物’的品种进行准确鉴定。因此，开展杂交兰种质资源的遗传多样性分析具有现实的指导意义。

SRAP分子标记主要针对基因的开放阅读框(ORF)进行扩增，因物种以及个体不同，内含子、启动子与间隔长度不等而产生丰富的多态性，不但集中了RAPD、SSR、AFLP 等常用分子标记的优点，还弥补了这些标记各自的缺点，已在多种植物上广泛应用[27-29]。应用DNA 分子标记研究兰属植物遗传多样性的文献也显示了SRAP 标记的多态率高且稳定[5-9,30]。本研究利用SRAP 标记对24份杂交兰种质进行遗传多样性分析，结果显示11对多态性引物共扩增出DNA条带119条，其中多态性条带102 条，多态性百分率达86.1%，说明SRAP 标记在国兰杂交兰的遗传多样性研究中有较高的检出率。种质间的遗传相似系数为0.43～0.98，表明种质间具有丰富的遗传多样性。

SRAP 标记的UPGMA 聚类分析结果表明，供试的24份种质可以较为清楚地区分开来。在遗传相似系数0.78时，种质间的亲缘关系与来源、花色、花型等有一定的相关性。如第Ⅰ类群第2亚类的‘立叶大凤’、‘绿翡翠’、‘玉凤’和‘黄金龙’均为小黄花素心品种，‘玉凤’是从‘绿翡翠’群体中的变异单株选育而来；第Ⅰ类群第4亚类的‘华韵丹霞’和‘华韵红霞’是同一父母本的姐妹品系。第Ⅱ类群第1亚类的‘韩国小姐’、‘紫元素’和‘西施’等3个红色系品种来源于韩国，而‘爪艺韩国小姐’是‘韩国小姐’的叶片突变品系。第Ⅲ类群的‘红美人’和‘K33a红美人’是来源于不同的母株组培快繁获得的2个群体，DNA水平上存在的遗传差异可能与植株的抽芽及开花性相关。同一个国家或地区的不同品种因亲本重复利用、种间杂交，基因交换频繁，品种遗传基础较为狭窄，品种间遗传相似性相对较高。聚类结果中也有不同来源地或不同花色、花型等类型的品种聚在一起，如第Ⅴ类群的‘台北小姐’与‘樱花’来源地不同，在花型、叶型等形态上也完全不同，这有待于今后研究中进行更多的验证。

对杂交兰品种间亲缘关系的SRAP 多态性分析还未见报道，关于其结果的严谨性还需要进一步结合形态评价、增加样本量深入的研究。从本研究的结果来看，效果较好，可将SRAP分子标记技术运用到杂交兰种质遗传关系分析、种质鉴定等，为杂交兰品种改良、分类命名及杂种后代鉴定等提供依据。

[1]朱根发. 国际兰属植物杂交育种进展[J].广东农业科学，2005，(4)： 25-27.

[2]陆然. 杂交兰：生产渐成规模 产销优势明显[J]. 中国花卉园艺，2013，(1)：23-24.

[3]LI G,QUIROS C F. Sequence-related amplified polymorphism(SRAP), a newmarker system based on a simple PCR reaction:Itsapplication to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor ApplGenet,2011,103(2):455-461.

[4]钟淮钦，钟海丰，林兵，等. 中小花型蝴蝶兰种质遗传多样性的形态与SRAP分析[J]. 分子植物育种，2013，11(1)：119-125.

[5]牛田，张林，王厚新，等. 利用SRAP 标记分析春兰种质资源遗传多样性[J]. 农学学报，2014，4(8)：53-58.

[6]蹇黎，朱利泉. 寒兰品种类型的SRAP 分子鉴定[J]. 中国农业科学, 2010，43(15)：3184-3190.

[7]唐源江，曹雯静，吴坤林. 基于SRAP 标记的国兰种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建[J]. 中国农业科学，2015，48(9)：1795-1806.

[8]蒋彧，何俊蓉，刘菲，等. 中国兰遗传多样性的SRAP 分析[J]. 西南农业学报，2013，26(4)：1645-1648.

[9]马红勃，赖鋆英，许旭明，等. 基于SRAP 标记的大花蕙兰种质资源遗传多样性分析[J]. 植物遗传资源学报，2011，12(4)：551-556.

[10]周艳霞，尹俊梅，任羽，等. 文心兰种质遗传多样性的SRAP 分析[J]. 热带农业科学，2009，29(7)：43-46.

[11]徐进，张西西，董爱香. 部分矮牵牛品种亲缘关系的SRAP 分析[J]. 园艺学报，2008，35(12)：1837-1842.

[12]赵秀娟，宋建文，胡开林. 苦瓜种质遗传多样性的SRAP 标记分析[J]. 植物遗传资源学报，2013，14(1)：78-84.

[13]马二磊，王燕，刘莉，等. 松花型花椰菜主要品种鉴定的分子标记分析[J]. 植物遗传资源学报，2010，11(5)：621-624.

[14]徐爱遐，马朝芝，肖恩时，等. 中国西部芥菜型油菜遗传多样性研究[J]. 作物学报，2008， 34(5)：754-763.

[15]昝逢刚，吴转娣，曾淇. 荔枝种质遗传多样性的SRAP 分析[J]. 分子植物育种， 2009，7(3)：562-568.

[16]林忠旭，张献龙，聂以春. 新型标记SRAP 在棉花F2分离群体及遗传多样性评价中的适用性分析[J]. 遗传学报，2004，31(6)：622-626.

[17]刘倩，戴志刚，陈基权，等. 应用SRAP 分子标记构建红麻种质资源分子身份证[J]. 中国农业科学，2013，46(10)：1974-1983.

[18]陈瑶瑶，张燕，张琛，等. 杂交兰‘韩国桃花’×蕙兰种间杂交种子无菌萌发特征研究[J]. 园艺学报，2009，36(3)：441-446.

[19]曾碧玉，常强，许传俊. 杂交兰品种‘韩国小姐’与墨兰品种‘企剑黑墨’杂交坐果及无菌播种研究[J]. 热带作物学报，2015，36(3)：510-515.

[20]左利娟，李志强，郑志勇，等. 杂交兰根状茎的增殖与分化成苗技术[J]. 江苏农业科学，2015，43(6)：54-55.

[21]谢利，马晓娟，郭和蓉，等. 杂交兰类原球茎增殖中芽分化的控制和快速繁殖[J]. 植物生理学报，2014，50(2)：209-213.

[22]孙瑶，赵福康，陈一. 肥料处理对杂交兰醉美人一年生苗生长的影响[J]. 浙江农业科学，2015，56(10)：1631-1632.

[23]王园园，尹翠翠，王广东. 高温胁迫对二倍体和四倍体杂交兰相关生理生化特征的影响[J]. 西北植物学报，2013，33(4)：735-740.

[24]谢佩吾，李早文，伍爱萍，等. 17个杂交兰及3个大花蕙兰品种的染色体研究[J]. 广东农业科学，2015，(8)：26-28.

[25]李永明，赵玉琪. 实用分子生物学方法手册[M]. 北京：科学出版社，2001：173-178.

[26]BUDAK H, SHEARMAN R C, PARMAKSIZ I, et al. Molecular characterization of buffalograss germplasmusing sequence-related amplified polymorphism markers[J]. Theoreticaland Applied Genetics, 2004, 108(5): 328-334.

[27]赵洋，杨阳，曾贞，等. SRAP标记在茶树育种上的应用前景[J]. 贵州茶叶，2007，34(2)：11-13.

[28]张彤，屈淑平，崔崇士. SRAP 标记在蔬菜作物遗传育种中的应用[J]. 东北农业大学学报，2009，40(1)：119-122.

[29]孙佳琦，梁建国，石少川，等. SRAP 标记在观赏植物遗传育种中的应用[J]. 分子植物育种，2010，8(3)577-588.

[30]蹇黎. ISSR 和SRAP 标记技术在兰花植物种质资源研究中的应用[J]. 北方园艺，2011，(23)：191-192.

(责任编辑：黄爱萍)

SRAP-marker Based Genetic Diversity of Germplasms ofCymbidiumHybrids

ZHONG Huai-qin1,2,3，LIN Rong-yan1,2,3，HUANG Min-ling1,2,3*，LIN Bing1,2,3，Chen Nan-chuan4

(I.InstituteofCropSciences,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.FlowersResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou,Fujian350013,China;3.FujianEngineeringResearchCenterforCharacteristicFloriculture,Fuzhou,Fujian350013,China;

4.FujianBainongEcologicalTechnologyLimitedCompany,Zhaoan,Fujian363500,China)

SRAP was applied for the determination of the genetic diversity of 24 hybrid cultivars ofCymbidium. Eleven polymorphic primer combinations were screened to result in 119 amplified DNA bands. Of the amplified DNA, 102 were polymorphic, at a ratio of 86.1%. The average number of polymorphic loci amplified by each primer was 9.3. The genetic similarity among the 24 germplasms ranged from 0.43 to 0.98, averaging 0.67. The UPGMA cluster analysis classified the germplasms with a similarity coefficient of 0.69 into 5 groups clearly showing the genetic diversity and relationship among the hybrids.

Cymbidiumhybrid; SRAP; genetic diversity; cluster analysis

2016-05-26初稿；2016-07-30修改稿

钟淮钦(1979-)，男，副研究员，主要从事观赏植物种质资源评价与创新利用研究(E-mail:zhqeeast@163.com) *通讯作者：黄敏玲(1960-)，女，研究员，主要从事花卉品种选育与生物技术研究(E-mail：huangm1618@163.corn)

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项 (2014R1025-5)；福建省农业科学院科技创新团队PI项目(2016PI-39)；福建省科技计划项目——星火计划重点项目 (2014S0014)

S 68

：A

：1008-0384(2016)11-1193-05

钟淮钦，林榕燕，黄敏玲，等.杂交兰种质资源遗传多样性的SRAP分析[J].福建农业学报，2016，31(11)：1193-1197.

ZHONG H-Q，LIN R-Y，HUANG M-L，et al.SRAP-marker Based Genetic Diversity of Germplasms ofCymbidiumHybrids[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1193-1197.