血小板源性生长因子C在家兔视网膜静脉阻塞模型的表达研究

冯燕兵钱 萍朱洁云翁文庆陈红明

血小板源性生长因子C在家兔视网膜静脉阻塞模型的表达研究

冯燕兵1钱 萍1朱洁云2翁文庆1陈红明1

目的研究家兔视网膜静脉阻塞（RVO）模型血小板源性生长因子C（PDGF-C）表达、作用及参与RVO新生血管形成的相关机制。方法通过氩激光光凝建立视网膜静脉阻塞家兔模型，观察结束后分别在1周、2周及4周三个时相点处死家兔，采取标本，观察病理改变，免疫组化法观察PDGF-C蛋白表达情况。结果与空白对照组比较，RVO家兔模型视网膜组织中各时相（1周、2周和4周组）PDGF-C蛋白表达均有不同程度的增高，差异有统计学意义 [（4.833±1.835）pg/mL、（10.500±1.634）pg/mL、（5.167±1.835）pg/mL比（2.167±0.408）pg/mL，孕＜0.01]，其中2周模型组与1周、4周模型组比较差异有统计学意义（孕＜0.01），1周模型组与4周模型组比较，孕=0.713。结论PDGF-C在家兔视网膜静脉阻塞血管内皮细胞中呈现高表达，预示其可能在RVO发生发展中起重要作用，且其表达程度与视网膜缺血具有一定的时间相关性。

家兔；视网膜静脉阻塞；PDGF-C；蛋白

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是一种以阻塞静脉远端迂曲扩张、阻塞点附近视网膜出血、水肿、渗出为临床特征，发病仅次于糖尿病性视网膜病变的视网膜血管疾病。RVO病程冗长，视网膜因缺血缺氧，多种因素导致新生血管形成，血管通透性提高，引发黄斑水肿、视网膜出血、玻璃体积血等严重危害视力的并发症。目前认为血管生成因子与血管抑制因子失衡是新生血管形成的主要机制。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进血管新生最重要的诱导因子[1]，近期研究表明，血小板源性生长因子C（plate let-derived growth factor-C，PDGF-C）在新生血管形成中同样发挥重要作用，其不仅能单独促进新生血管生成，同时对同为血管生成因子的VEGF具有促进作用[2]。本实验通过激光光凝建立兔RVO模型，观察视网膜组织中PDGF-C蛋白表达，探讨其在RVO发病中的作用及相关机制，为临床防治RVO提供数据支持。

1 材料

1.1 动物及分组 普通级健康实验家兔14只，购自嘉兴学院医学院动物实验中心，许可证号:SCXK（浙）2013-0056，眼前节、眼底检查无异常，白色，雌雄不限，体质量约2.0～2.5kg，随机分为空白对照组（5只，10眼）与模型组（9只，18眼）两组。

1.2 药品及试剂 复方托吡卡胺滴眼液（山东博士伦福瑞达制药有限公司生产，批号H20023089）；20%乌拉坦（嘉兴学院医学院提供）；10%的中性甲醛固定液、双氧水（嘉兴市中医院病理科提供）；PDGF-C（一抗:艾博抗贸易有限公司，二抗:碧云天生物技术有限公司）；胃酶抗原修复液（福建迈新生物技术开发公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

2 方 法

2.1 动物模型制作 模型组兔参照卢海等[3]介绍激光造模方法造模，复方托吡卡胺滴眼液充分扩瞳，20%乌拉坦全身麻醉，先拍摄无赤光眼底像，角膜表面麻醉，放置三面镜，以氩离子激光封闭兔视网膜视乳头两侧髓翼血管系之主干静脉（光凝斑直径200～250μm，功率600～800mW，时间0.3～0.5s）。造模中激光光准确聚焦主干静脉，不伤及邻近动脉，参照文献[3]光凝封闭的静脉段长度约1PD，直至被封闭静脉变细发白，血流停滞，远端迂曲扩张，且由远端向近端光凝照射。激光光凝封闭视网膜静脉24h后作眼底彩色照相及眼底血管造影（FFA）观察血管闭塞情况，验证造模是否成。若闭塞不完全则补充光凝封闭，封闭视网膜静脉后拍摄眼底无赤光像，并再行FFA证实静脉已被阻塞，血流中断。术后每日散瞳，检眼镜查眼底（1周内每天1次，以后每周1次，观察阻塞血管与视网膜改变），同时观察眼前段。

2.2 视网膜组织HE染色与免疫组织化学染色 分别在造模后第1周、第2周及第4周，空气处死动物，及时摘除眼球，并去除眼前节及玻璃体形成眼杯，移入10%中性甲醛中保存。将制成的眼杯取出，杯口朝向操作者，以视神经为界，垂直于视盘两侧髓线方向，用锐利刀片将眼杯分为两部分，再将其切成数块，每块约3mm×3mm大小，用10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋,切片（厚度为4μm），分别作HE染色与免疫组化。免疫组化染色判断标准:以细胞质中见到棕黄色颗粒为阳性。取对照组未经染色的石蜡切片，用同样方法进行染色作为正常对照组；取删除一抗，用PBS代替，其余染色方法相同的切片作为阴性对照组；取结肠癌患者组织石蜡切片，用同样方法进行染色作为阳性对照组。染色均使用同一批试剂、同一试剂盒抗体及同一人完成。染色结果半定量分析:组织切片中胞质染为淡黄色至棕褐色者为阳性细胞标志，染色强度以呈现的染色特性（染色深浅需与背景着色相对比）计分:无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比即一个视野内染色阳性的血管数占总血管数的百分比:0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。每张切片随机取2 个400倍视野,每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比计分，染色强度与阳性细胞百分比的乘积，综合计算每眼免疫组化平均分数。

2.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，所有数据均采用均数±标准差（±s ）表示，进行方差分析、Dunnett检验、LSD法，以孕＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 兔视网膜静脉阻塞模型建立 模型组9只家兔（18眼）中，经眼底血管造影（FFA）证实，视网膜静脉成功封闭，13只眼一次造模成功，有5只兔眼光凝封闭不完全，于造模术后第二天再通，再次行激光光凝封闭，经FFA证实视网膜静脉成功封闭。造模成功次日，即阻塞静脉近端、远端扩张，血管走行紊乱，表层网膜少量出血（图1，见封底）。造模2天后，网膜血管可见火焰状出血（图2，见封底）。网膜光凝术后1天，有5眼中网膜侧支循环形成，补充光凝激光。18只眼均始终未见虹膜新生血管出现。

正常家兔眼组织切片，光镜下视网膜各层次结构整齐，网膜血管位于视网膜表面或神经节细胞浅层，颗粒层细胞排列紧密（图3，见封底）。模型组家兔眼组织切片，光镜观察细胞层次结构混乱，内层视网膜静脉淤血，广泛水肿，血管内皮细胞壁损伤，伴有神经纤维层空泡（图4，见封底）。

3.2 免疫组化结果

3.2.1 空白对照组网膜PDGF-C表达 PDGF-C特异性染色阳性表达在细胞浆，呈棕黄色，细胞核不着色（阳性对照组，图5，见封底），阴性对照组中未见网膜组织着色（图6，见封底），正常视网膜组织中主要分布在神经节细胞、神经纤维层，内外界膜、血管内皮细胞几乎不着色（图7，见封底）。

3.2.2 模型组网膜PDGF-C表达 RVO家兔模型组造模1周后，家兔网膜组织中PDGF-C表达分布与正常家兔几乎相同，但染色强度和密度有所增强，血管内皮细胞出现少许的淡黄色弱染色（图8，见封底）；造模2周后，表达增强，阳性表达细胞数明显增加，血管内皮细胞染色颗粒显著加深，呈棕褐色强着色（图9～10，见封底）；造模4周后，PDGF-C蛋白表达减弱，血管内皮细胞染色变淡，颗粒呈棕黄色（图11，见封底）。

3.3 各组家兔视网膜PDGF-C表达 与空白对照组比较，1周、2周及4周模型组差异具有统计学意义（孕＜0.01）。2周模型组与1周、4周模型组比较，差异具有统计学意义（孕＜0.01），而1周模型组与4周模型组比较，孕=0.713，见表1。

表1 各组家兔视网膜PDGF-C表达（pg/mL±s）

表1 各组家兔视网膜PDGF-C表达（pg/mL±s）

注:与空白对照组比较，△孕＜0.01；与2周模型组比较，*孕＜0.01；PDGFC:血小板源性生长因子C

4 讨论

RVO后期出现的黄斑水肿、玻璃体出血、高眼压等严重危害视力的并发症多由眼内新生血管引起，研究[4]表明，抗新生血管的治疗能够抑制血管新生，减少并发症，提高患者视力。当前研究认为，血管生成因子与血管抑制因子失衡是新生血管形成的主要机制。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进血管新生最重要的诱导因子[1]，近年来应用于临床的以VEGF或其信号通路的相关环节为治疗靶点的抗VEGF药物获得较好疗效，而在临床中出现应用抗VEGF治疗后视力没有上升的无应答现象，可能原因为抗VEGF药物只能抑制VGEF依赖通路的信号传导，而非VGEF依赖促进新生血管生长的通路未被抑制，故可发生无应答现象。PDGF-C不仅能对同为血管生成因子的VEGF具有促进作用，同时可单独促进新生血管生成[5]，故推测PDGF-C抑制剂可能在这一过程里发挥重要的作用。

PDGF家族成员包括PDGF-A、PDGF-B、PDGFAB、PDGF-C、PDGF-D。PDGF-C是PDGF家族近十余年新发现的成员，是一种多亚基蛋白，共有345个氨基酸残基。研究发现，PDGF-C在新生血管形成中发挥重要作用。PDGF-C能通过旁分泌或自分泌方式促进周细胞、细胞外基质和血管平滑肌细胞增生、迁移与趋化，还可直接作用于血管内皮细胞，而这些在新生血管形成过程中起到重要的作用[6]。研究发现，PDGF-C在体内的活性形式PDGF-CC可通过上调VGEF、PDGF-BB6及基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）[7]，释放促血管生成因子，又可通过促巨噬细胞游走，调节糖原合成酶激酶类3β（GSK-3β）磷酸化[8]促进眼内新生血管生成；而阻滞PDGF-CC后可抑制上述因子的表达[8]。

Tang等[8]研究表明，PDGF-C在眼内呈高表达，Li等[2]研究发现PDGF四个家族成员皆可在成熟RPE中表达，而PDGF-C的mRNA表达水平是PDGF-A 和PDGF-B的100倍。在本实验中，我们发现正常视网膜组织中神经节细胞、神经纤维层、内外界膜皆发现PDGF-C蛋白阳性表达，血管内皮细胞几乎不着色，在RVO模型组视网膜组织中其表达皆有明显提高。Hou等[6]发现在应用激光建造的脉络膜新生血管（choroidalneovascularization，CNV）模型中PDGF-CC呈现高表达，并且在进一步的研究中发现与激光治疗后注射VEGF中和抗体相比，每眼玻璃体腔单次注射2μg PDGF-CC中和抗体在不同时间皆能减少CNV病变区域（n=8，孕＜0.05），且能上调 PDGF/ PDGFR的抑制剂TNF-α；进一步研究表明激光治疗后予玻璃体或视网膜下间隙注射 PDGF-CC shRNA能使PDGF-CC表达减少下降40%，并能明显减少CNV区域（n=8，孕＜0.05或孕＜0.01）；并且荧光素造影显示PDGF-CC中和抗体治疗后CNV血管渗漏明显减少，组织学检测示纤维血管组织生成明显减少；本实验中发现PDGF-C在RVO模型视网膜组织中表达显著增加，在第2周时最为明显，内核层、神经节细胞表达增强，阳性细胞数增加，尤其血管内皮细胞染色颗粒显著加深，呈棕褐色强着色，在第4周时，PDGF-C表达明显减弱，我们认为这与健康家兔自我修复能力强，侧支循环形成速度快有关。李芳等[9]模拟缺氧环境体外培养hRPE细胞，采用逆转录PCR与ELISA法检测PDGF mRNA和蛋白表达，采用MTT法检测hRPE细胞增生率，研究发现缺氧能促进PDGF的表达，PDGF表达上调可显著促进hRPE细胞增生。本研究中人为造成家兔视网膜组织缺血缺氧状态，结果显示缺血区域的视网膜组织PDGF-C蛋白表达明显增加。

动物模型是人类研究疾病的重要实验方法和手段，国内外眼科学者利用RVO动物模型进行了诸多研究，为人类认识、治疗及预防RVO提供了重要的参考资料。尽管家兔动物模型也出现视网膜出血、水肿、血管迂曲、微血管瘤、荧光素渗漏及无灌注区等RVO典型的临床与病理改变，但其眼底改变与临床RVO患者并非完全相同。如实验性RVO 1～2周即可产生致密毛细血管簇，形成侧支循环，这与临床RVO不一致，临床RVO患者眼底血管渗漏持续数月甚至数年之久，这种差异可能原因:临床RVO患者大多为中老年人，常伴有高血压、动脉硬化等全身性疾患，其视网膜血管及循环功能常处在病理状态，这种病态基础可促进并加重RVO病情发展，而实验所用家兔本身健康，眼底血管无异常病理改变，血管突然阻塞可迅速产生侧支循环进行代偿修复，故评估RVO动物模型疗效要充分考虑侧支循环建立的因素。

本实验结果提示，模型组PDGF-C蛋白表达明显增加，1周、2周及4周模型组与空白对照组相比差异具有统计学意义（孕＜0.01）。结果表明，缺血区域视网膜PDGF-C有不同程度的表达，具有一定的时间相关性，其中以血管内皮细胞中表达最强。由此推测PDGF-C可能参与视网膜新生血管的形成，介入视网膜静脉阻塞病情发展。

［1］Zhao S，Huang L，Wu J，et al.Vascular endothelial growth factor upregulates expression of annexin A2 in vitro and in a mouse model of ischemic retinopathy［J］.Mol Vis，2009， 15:1231-1242.

［2］Li R，Maminishkis A，Wang FE，et al.PDGF-C and-D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48（12）:5722-5732.

［3］卢海，张惠蓉.兔视网膜静脉阻塞眼视网膜新生血管组织中血管内皮生长因子mRNA的表达［J］.中华眼底病杂志，2001，17（1）:5-7.

［4］黎晓新.眼内抗血管生成药物临床应用的利与弊［J］.中华眼科杂志，2012，48（l0）:870-873.

［5］Lee C，Zhang F，Tang Z，et al.PDGF-C:a new performer in the neurovascular interplay［J］.Trends Mol Med，2013，19 （8）:474-486.

［6］Hou X，Kumar A，Lee C，et al.PDGF-CC blockade inhibits pathological angiogenesis by acting on multiple cellular and molecular targets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107 （27）:12216-12221.

［7］Wagsater D，Zhu C，Bjorck HM，et al.Effects of PDGF-C and PDGF-D on monocyte migration and MMP-2 and MMP-9 expression［J］.Atherosclerosis，2009，202（2）:415-423.

［8］Tang Z，Arjunan P，Lee C，et al.Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation［J］.J Exp Med，2010，207:867-880.

［9］李芳，李敏，邢怡桥，等.缺氧及小干扰RNA转染对人RPE细胞增生及血小板源性生长因子-BB表达的影响［J］.中华实验眼科杂志，2014，32（6）:525-530.

（收稿:2015-12-20 修回:2016-03-02）

Expression of Platelet Derived Growth Factor C in the Retina of Rabbit with Retinal Vein Occlusion

FENG Yanbing1,QIAN Ping1,ZHU Jieyun2,WENG Wenqing1,CHEN Hongming1.1 Jiaxing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiaxing(314001),China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)，China

ObjectiveTo observe the expression of platelet-derived growth factor-C（PDGF-C）in the retina of rabbits with retinal vein occlusion（RVO）,and to investigate the effect of PDGF-C in RVO and the possible mechanism in the pathogenesis of retinal neovascularization.MethodsThe RVO of rabbit model was established with argon laser photocoagulation.After the 1st week,2ed week,and 4th week,the rabbits were sacrificed to observe the pathological changes by H-E staining and the expression of PDGF-C protein by immunohistochemistry.ResultsCompared with control group,the expression of PDGF-C protein in RVO rabbit model was significantly higher after the 1st,2 nd,and 4th week,with a statistically significant difference（4.833 1.835 pg/mL,10.500 1.634 pg/mL,5.167 1.835 pg/mL vs 2.167 0.408 pg/mL,孕＜0.01）.A significant difference in the expression of PDGF-C protein was found between 2nd week and 1st and 4th week（孕＜0.01）,but there was no significant difference between 1st week and 4th week（孕=0.713）.ConclusionPDGF-C is highly expressed in vascular endothelial cells of rabbits with RVO,indicating that it may play an important role in the development of RVO,and that its expression level has a certain time correlation with retinal ischemia.

rabbit;retinal vein occlusion;PDGF-C;protein

浙江省嘉兴市科技计划项目（No.2015c23020）

1浙江省嘉兴市中医院眼科（冯燕兵、翁文庆、陈红明）、病理科（钱萍）（嘉兴 314001）；2浙江中医药大学（杭州310053）

翁文庆，Email:wengwenq@163.com