河南省26例甲型副伤寒沙门菌聚集性病例的病原学研究及溯源分析

赵嘉咏，张白帆，穆玉姣，苏 佳，黄学勇，夏胜利，谢志强，许汴利

河南省26例甲型副伤寒沙门菌聚集性病例的病原学研究及溯源分析

赵嘉咏，张白帆，穆玉姣，苏 佳，黄学勇，夏胜利，谢志强，许汴利

目的 分析2015年3-7月份河南省登封市分离自临床诊断为副伤寒聚集性病例的甲型副伤寒(S.ParatyphiA)沙门菌病原学特征及分子流行病学关联。方法采集副伤寒病例患者的静脉血8～10 mL，双相血培养瓶37 ℃培养4～7 d，沙门菌科玛嘉选择性培养基分离培养，系统生化鉴定，丹麦SSI分型血清进行沙门菌O抗原及H1/2相鞭毛诱导血清凝集试验。根据PulseNet China病原体分子分型网络实验室公布的沙门菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)操作指南与美国临床实验室标准化协会(CLSI)沙门菌K-B法药敏测试方案对其进行XbaI/BlnI双酶切PFGE分子分型与聚类分析及8类13种抗生素药敏测试。结果从29例病人血培养物中共分离到26株甲型副伤寒沙门菌，其经XbaI与BlnI限制性双酶切和PFGE电泳后带型完全一致(PTYA1)；药敏测试结果显示24株甲型副伤寒沙门菌耐药表型一致。结论病原学诊断及PFGE分子分型结果证实了26例甲型副伤寒沙门菌感染病例间可能存在高度的聚集性与分子流行病学关联，为进一步的追踪溯源和调查取证提供了技术支撑。

甲型副伤寒沙门菌； 聚集性病例；药敏测试；PFGE

甲型副伤寒是由甲型副伤寒沙门菌引起的急性消化道传染病，临床上以持续高热、相对缓脉、特征性中毒症状、肝脾肿大、玫瑰疹与白细胞减少等为特征，肠出血、肠穿孔为主要并发症。该病终年可发病，以夏秋季为多，一般呈散在发生，可出现局部暴发或流行，是我国法定报告的乙类传染病之一[1-2]。登封市是河南省肠道传染病及伤寒副伤寒重点监测哨点地区之一，也是河南省历年来甲型副伤寒散发和暴发病例的最主要来源地。2015年3月起，该地区临床诊断副伤寒病例异常增多，病例无显著时空聚集性，初步怀疑为散发性暴发事件，随即河南省CDC传染病实验室开展了病原学诊断与脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型与聚类分析，为临床治疗和及时启动流行病学调查及防控措施的制定提供病原学依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2015年3-7月间采集自河南省登封市2家医院临床诊断为副伤寒的病人静脉血8～10 mL。26例病人中22例在市区内，4例在城郊，呈市区聚集高发；职业分布广泛，农民14例、学生4例、干部职员和工人各6例、餐饮食品从业人员1例、幼托儿童1例。不同年龄组均有发病，以青壮年居多。对所有病例在外就餐或食用外购食品情况调查，未发现共同暴露史。病例年龄主要集中于18～40岁，其中2～5岁1例，8～18岁4例，19～40岁21例；男性14例，女性12例，男女性别比1.2∶1。临床症状以发热、畏寒、头痛为主。最高体温波动在38.4 ℃～41.7 ℃，热型以驰张热最多，计有18例(69.2%)；其次为不规则热，共计8例(30.8%)。7%～25%的病例有腹泻、腹痛和便秘等消化道症状，均无玫瑰疹、表情淡漠、相对缓脉和肝脾肿大等典型症状，详见表1。

表1 26例甲型副伤寒病例临床表征统计

Tab.1 Clinical characterization of 26 paratyphoid A cases

临床表现Clinicalsymptoms例数Case比例%Percentage发热fever26100．0畏寒Chills2492．3头痛headache1973．1头晕dizziness1246．2腹泻diarrhea726．9腹痛bellyache415．4恶心sickness311．5便秘constipation27．7

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 双相血培养瓶购自郑州贝瑞特生物有限公司；沙门菌科玛嘉鉴定培养基购自法国CHROMAgar公司；M-H琼脂及药敏纸片购自英国OXOID公司；API20E肠杆菌科细菌鉴定板条购自法国bioMérieux公司；沙门菌分型血清购自丹麦SSI公司；SeakemGold琼脂糖购自瑞士LONZA公司；蛋白酶K购自英国Roche公司；限制性内切酶XbaI购自大连宝生物公司；1 mol/L Tris-Hcl(pH8.0)、0.5 mol/L EDTA(pH8.0)、5×TBE购自Solarbio公司。

1.2.2 主要仪器 药敏纸片分配器购自英国OXOID公司；VITEK2浊度仪购自法国bioMérieux公司；去离子水系统购自美国Milipore公司；脉冲场凝胶电泳及凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 甲型副伤寒沙门菌分离培养、生化鉴定与血清学分型 无菌抽取临床诊断为副伤寒病人的静脉血8～10 mL，双相血培养瓶37 ℃培养4～7 d，挑取固相培养基上菌落或浑浊态培养液接种于沙门菌科玛嘉选择性培养基，37 ℃培养16～18 h后挑取边缘整齐、光滑、凸起的淡紫色菌落转种脑心浸液平板，0.85%生理盐水制备0.5麦氏浊度菌液，API20E肠杆菌科系统生化板条鉴定，SSI沙门菌诊断血清进行O相玻片凝集分型，再利用0.4%营养软琼脂进行H相(1/2相)鞭毛诱导与血清凝集，生理盐水做自凝对照。根据卡芙曼-怀特(Kauffmann-White)血清分型表确定对应血清型别[3]。

1.3.2 脉冲场凝胶电泳分型 按照Pulsenet China网络实验室公布的沙门菌脉冲场凝胶电泳标准分型方法[4]，对甲型副伤寒沙门菌株进行分子分型，标准株H9812作为分子量标记。限制性内切酶XbaI/BlnI(50U)，37 ℃酶切2.5 h。电泳参数：电压6 V/cm，脉冲时间2.2～63.8 s，线性转换，电场夹角120°，电泳时间19 h，电泳液温度14 ℃。电泳结束后胶块用GelRed染料染色20 min后纯水清洗30 min后凝胶成像仪拍照(曝光时间3.0 s，去过饱和成像)。

1.3.3 药敏试验 参照WHO推荐的Kirby-Bauer法[5]，将甲型副伤寒沙门菌转种脑心浸液琼脂平板，37 ℃培养16 h后0.85%生理盐水制成0.5麦氏单位悬液。用无菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布于M-H平板表面，用分配器将药敏纸片压盖其上，15 min内送37 ℃温箱培养18 h以后测量各药敏纸片抑菌圈直径，参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2009年标准进行耐药表型判定，大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。

1.3.4 数据分析 用BioNumerics6.0软件对电泳图谱进行数据分析，绘制聚类分析树状图。聚类算法为非加权配对平均法(UPGMA, Dice)，电泳条带位置优化度(Position tolerance)1.5%，相似度100%认定为同一PFGE带型[6]。

2 结 果

2.1 沙门菌鉴定与血清学分型结果 26株沙门菌在沙门菌科玛嘉培养基上均为紫红色、边缘整齐、光滑凸起小菌落； API20E肠杆菌科系统生化鉴定为沙门菌(ID%99.2%)，血清抗原式为1,2,12:a:-，参照卡芙曼-怀特(K-W)沙门菌血清分型手册判定均为甲型副伤寒沙门菌。

2.2 药敏测试结果 26株甲型副伤寒沙门菌中24株耐药表型一致，其对氨苄西林(AMP)、增效磺胺类抗生素甲氧苄氨嘧啶(TMP)、四环素(TET)、链霉素(STR)、萘啶酸(NAL)、氯霉素(CHL)、头孢噻肟(CTX)及复方新诺明(STX)耐药； 对环丙沙星(CIP)、头孢吡肟(FEP)、诺氟沙星(NOR)、头孢他啶(CAZ)、庆大霉素(GEN)敏感；其余2株菌耐药谱与上述菌株有所不同，详见表2。

表2 26株甲型副伤寒沙门菌多重耐药谱

Tab.2 Multi-drug resistance spectrum of 26 strains S. paratyphi A

耐药状况Drugresistancekinds耐药谱Drugresistancespectrum菌株数Strains耐6种SixkindsofresistanceAMP⁃CTX⁃TMP⁃NAL⁃CHL⁃SXT1耐8种EightkindsofresistanceAMP⁃TMP⁃TET⁃STR⁃NAL⁃CHL⁃CTX⁃SXT24耐9种NinekindsofresistanceAMP⁃TMP⁃CIP⁃TET⁃STR⁃NAL⁃CHL⁃NOR⁃SXT1

2.3 PFGE分子分型与聚类分析结果 26株甲型副伤寒沙门菌经XbaI/BlnI双酶切后带型完全一致，命名为PTYA1，带型相似度99.9%，具有显著的带型聚集性特征；从分子流行病学角度可高度怀疑由单一传染源导致，详见图1。

图1 26株甲型副伤寒沙门菌XbaI/BlnI双酶切PFGE与聚类分析图谱Fig.1 XbaI/BlnI PFGE cluster analysis of 26 strains of S. paratyphi A

3 讨 论

登封市地处河南省中部，旅游业和商业发达，人员流动性较强。2007年，登封市曾经暴发过一次较大规模的甲型副伤寒疫情，波及范围广，持续时间长，罹患人数多，给当地经济与社会发展造成了很大的影响，引起了相关政府部门的高度重视。近年来，当地政府指定专门的医疗机构收治伤寒副伤寒病人并在全市范围内持续开展大规模的爱国卫生运动和健康宣教活动，加强对病例的发现、治疗和管理。由于甲型副伤寒慢性带菌者的持续存在，疾病传染源的多样性及传播途径不易彻底切断和人工免疫效果欠佳等原因，当地新发散发性病例仍时有出现，3年来其实验室确诊的病例数已占到河南省监测病例数的97%以上。从2015年3月开始，当地病例数突然增多，至7月份已增至58例，具有初步的聚集性特征，尽管时空跨度相对较大，但足以引起我们的重视。通过对所有病例流行病学调查，未发现共同接触史、暴露史及饮水、食品等商品化暴露因素，这在河南省以往的沙门菌暴发病例中是比较罕见的。结合病原学诊断和流行病学资料综合分析，我们高度怀疑这是一起由甲型副伤寒沙门菌感染引起的散发性暴发事件。 同时，确诊病例以发热、畏寒、头痛为主，无出疹、肝脾肿大等典型症状，这也是近年来河南省以甲型副伤寒为代表的副伤寒病的主要临床特征。从治疗情况看，大部分病人普遍对三代氟喹诺酮类、四代头孢及部分三代头孢类等临床一线用药较为敏感，疗效较为显著，这和药敏测试结果基本是一致的。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术能够对类似本案例这种以高度散发形式存在的、在较长时间范围内跨地域传播的病例进行溯源调查分析，查找出各病例间的流行病学关联，这是以往靠传统流行病学调查方法无法实现的，是现代分子生物学技术与现场流行病学结合的产物。在美国“鼠伤寒沙门菌污染花生酱事件”、欧洲“O104出血性大肠杆菌”暴发疫情及国内类似疫情的处置过程中，以PFGE技术为代表的网络化监测溯源平台就发挥了不可替代的重要作用。在本研究中，我们就利用该技术将分布于不同地点不同发病时间的甲型副伤寒沙门菌散发性病例成功建立了流行病学关联。PFGE聚类分析技术虽然是比较成熟的技术体系，但是想要充分发挥它的作用，仍需要在试剂、方法、人员操作、分析算法等各个环节做好质量控制和标准化工作，否则就容易在病例间建立错误的关联，将流行病学调查指向错误的方向。PFGE技术目前在分辨度和识别力方面仍具有一定的技术局限性，提醒我们在实践中要充分结合和深入分析病原学与流行病学信息，发挥各自优势的同时紧密合作，才能更好的把握疾病传播特点，发挥PFGE技术在疾病防控、突发公卫事件/疫情处置中的作用。

本研究中，24株甲型副伤寒沙门菌药敏测试显示其对青霉素类、部分三代头孢类、一代喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类等8种抗生素呈耐药性，且其多重耐药谱又与PFGE带型聚集性高度一致。这既反映了河南省病人分离株耐药问题的严重性，也说明了基于共同暴露源的菌株往往具有相同的耐药基因和表型特征，这种特征尽管存在变异性和不确定性，但在一定范围内可为及早发现聚集性病例提供重要线索。由于客观原因我们在调查过程中始终未能从食物、水体等环境样本中检测出甲型副伤寒沙门菌，本文聚集性病例的调查没有形成完整的病原学证据链，只能推论为由单一传染源引起的散发性暴发，还需要做进一步深入研究和分析。

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Pathogenic investigation and molecular tracing analysis in 26 clustered cases ofSalmonellaparatyphiA in Henan Province, China

ZHAO Jia-yong, ZHANG Bai-fan, MU Yu-jiao, SU Jia, HUANG Xue-yong,XIA Sheng-li, XIE Zhi-qiang, XU Bian-li

(CenterforDiseaseControlandPreventionofHenanProvince,Zhengzhou450016,China)

To investigate the etiological characteristics and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) patterns ofSalmonellaparatyphiA strains isolated from patients of clustered cases in 2015 in Dengfeng City, Henan Province, 8-10 mL venous blood samples were collected from patients of paratyphoid and cultured in double phase blood culture bottle for 4-7days, then suspicious strains were identified and been madeSalmonellaO antigen and H1/2 phase flagellum-induced serum agglutination test by API20E biochemical systems and SSISalmonellatyping sera. According toSalmonellamolecular typing and K-B drug susceptibility testing method published by PulseNet China bacterial infectious disease monitoring network and USA clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), we analyzed drug sensitivity and PFGE molecule characteristics ofS.paratyphiA strains isolates from patients. Results showed that 26 strains ofS.paratyphiA were isolated from 29 cases of blood samples, the antigen modes of them were 1,2,12:a:-. They were divided into only one molecular patterns (PTYA1) by digestion withXbaI/BlnI and pulsed field gel electrophoresis. The pattern similarity were 100%. Drug susceptibility test results also showed most strains had the same resistant phenotypes with the consistent resistance spectrum for AMP-TMP-TET-STR-NAL-CHL-CTX-SXT. The PFGE technology confirmed the molecular epidemiological relevance among 26S.paratyphiA infection cases, providing the technical support for further epidemiological tracing and investigation.

SalmonellaparatyphiA; clustered cases; AST; PFGE Supported by the National Science and Technology Major Project(Nos. 2012ZX10004201 & 2012ZX10004203) Corresponding author: Xu Bian-li, Email: xubl@hncdc.com.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.015

国家科技重大专项(No.2012ZX10004201和No.2013ZX10004203)联合资助

许汴利，Email：xubl@hncdc.com.cn

河南省疾病预防控制中心，郑州 450016

R373

B

1002-2694(2016)12-1122-04

2016-04-06；

2016-07-13